三種抗隱性孔雀石綠重組抗體的表達(dá)與免疫分析特性研究.pdf

1、孔雀石綠（MalachiteGreen，MG）是一種有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，進(jìn)入水產(chǎn)動物體內(nèi)后，會被代謝還原成為無色的隱性孔雀石綠（Leucomalchite Green，LMG）。MG及LMG對水生生物和人體具有致癌、致突變、致畸作用。我國已經(jīng)嚴(yán)令禁止其應(yīng)用于水產(chǎn)保鮮中，但違禁使用現(xiàn)象仍有發(fā)生，需要加強(qiáng)監(jiān)測。免疫檢測方法具有簡單、快捷、靈敏的特點(diǎn)，是一種高通量的篩選手段。免疫檢測方法的核心材料是抗體?；蚬こ炭贵w是繼多克隆抗體、單克隆

2、抗體之后的第三代抗體，具有制備周期短、可大規(guī)模發(fā)酵制備等優(yōu)點(diǎn)，是近年來的研究熱點(diǎn)。本論文在前期獲得的抗LMG的單鏈抗體scFv基礎(chǔ)上，構(gòu)建了scFv-Biotin，F(xiàn)ab，scFab三種重組抗體，并以其分別建立免疫檢測法，進(jìn)而對三種抗體的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）三種重組抗LMG抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
　　抗LMG的生物素標(biāo)記單鏈抗體表達(dá)載體pComb3xss-LMG-scFv-BirA的構(gòu)建與

3、鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道BirA酶基因序列設(shè)計(jì)引物，以大腸桿菌DH5α菌株為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到大小約1000 bp的PCR產(chǎn)物并測序。將序列放入在線網(wǎng)站Blast進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與已公布的BirA酶基因序列一致。將LMG-scFv基因和BirA酶基因分別連接到載體pComb3xss，經(jīng)酶切與測序鑒定，重組質(zhì)粒pComb3xss-LMG-scFv-BirA構(gòu)建成功。
　　抗 LMG的Fab抗體表達(dá)載體 pComb3xss-LM

4、G-Fab的構(gòu)建與鑒定。以pComb3xss-LMG-scFv-BirA重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得357 bp的VH基因和324 bp的VL基因。以p3MH-Fab為模板擴(kuò)增獲得306 bp的CH1基因和318 bp的CL基因。用重疊延伸PCR方法分別將VH和CH1、VL和CL拼接，獲得663 bp的Fd段和642 bp的κ基因。將Fd段和κ段分別酶切連接到載體pComb3xss，酶切與測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pComb3xss-LMG-F

5、ab構(gòu)建成功。
　　抗 LMG的scFab抗體表達(dá)載體 pComb3xss-LMG-scFab的構(gòu)建與鑒定。以pComb3xss-LMG-Fab重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得Fd和κ基因。用重疊延伸PCR方法將Fd和κ基因用連接肽(Gly4Ser)3連接，獲得1362 bp的scFab基因。將scFab基因連接到載體 pComb3xss，并經(jīng)過酶切與測序鑒定，表明重組質(zhì)粒pComb3xss-LMG-scFab構(gòu)建成功。
　?。?）

6、三種重組抗體的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定
　　將三種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Top10’中，構(gòu)建三種工程菌。在28℃培養(yǎng)條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組抗體，提取周質(zhì)蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blotting的方法鑒定，結(jié)果表明成功獲得約28 kDa的LMG-scFv，且在表達(dá)過程中LMG-scFv被標(biāo)記上生物素；LMG-Fab的蛋白電泳結(jié)果顯示，在分子量約為27 kDa處有一明顯條帶，與Fab打開二硫鍵后的κ鏈大小相符。另外，表

7、達(dá)出的LMG-scFab分子量約為54 kDa，大小與預(yù)期相符。
　?。?）三種重組抗體的免疫分析特性比較研究
　　通過間接競爭ELISA，以表達(dá)獲得的三種重組抗體分別建立針對LMG的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。采用LMG-scFv-Biotin時(shí)，對LMG的半抑制濃度IC50為20.11 ng/mL，線性檢測范圍在4.11~98.56 ng/mL之間;采用LMG-Fab時(shí)，IC50為45.56ng/mL，線性檢測范圍為12.80~162