隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備及電化學(xué)阻抗免疫傳感器的組裝.pdf

1、隱性孔雀石綠是三苯甲烷類(lèi)化學(xué)物孔雀石綠在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和存在形式，殘留時(shí)間長(zhǎng)，由于其潛在的高毒、高殘留、“三致”等毒副作用，很多國(guó)家，包括我國(guó)已經(jīng)嚴(yán)格限制其使用，但是違規(guī)添加事件屢有發(fā)生，給人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。因此，極有必要建立隱性孔雀石綠及孔雀石綠的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，得到科學(xué)即時(shí)的結(jié)果，這樣才能實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)督，保障和促進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)品行業(yè)的發(fā)展。本文研究的具體內(nèi)容如下：
　　根據(jù)化學(xué)合成原則和半抗原設(shè)計(jì)要求，采用以原料為基

2、礎(chǔ)，從源頭進(jìn)行合成的方法，合成了四種含不同基團(tuán)和長(zhǎng)度連接臂的半抗原，并且提出了一種新的隱性孔雀石綠半抗原的合成路徑，以純碳鏈作為連接臂，并可以通過(guò)更換反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)連接臂的延長(zhǎng)。對(duì)設(shè)計(jì)合成的目標(biāo)產(chǎn)物分別進(jìn)行薄層色譜法、質(zhì)譜掃描和核磁氫譜鑒定，證實(shí)已成功制備隱性孔雀石綠半抗原，且純度均在95％以上。
　　將設(shè)計(jì)合成的半抗原分別通過(guò)碳二亞胺法與BSA和OVA偶聯(lián)，并且經(jīng)過(guò)紫外光譜和MALDI-TOF-MS對(duì)完全抗原進(jìn)行鑒定和偶聯(lián)比的計(jì)算，

3、結(jié)果表明完全抗原制備成功，且免疫原的偶聯(lián)比介于10:1～20:1之間。選用適齡兔進(jìn)行多克隆抗體的免疫制備，用 ELISA方法檢測(cè)得到的抗血清的效價(jià)和靈敏度，確定反應(yīng)終點(diǎn)。選用效果最好的抗血清，進(jìn)行ELISA工作條件的優(yōu)化，建立隱性孔雀石綠酶聯(lián)免疫吸附分析方法。結(jié)果表明，建立的隱性孔雀石綠ELISA檢測(cè)方法的靈敏度為2.21 ng/mL，線(xiàn)性范圍為0.15～31.7 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.06 ng/mL，并用于魚(yú)肉樣品的實(shí)際檢測(cè)中

4、，回收率為79.8～92.4%。
　　選用優(yōu)化得到的抗體進(jìn)行電化學(xué)阻抗免疫傳感器的組裝，并用電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行定性和定量分析。通過(guò)對(duì)苯二胺重氮化修飾玻碳電極，將蛋白還原的納米金簇共價(jià)連接到電極表面，并用EDC/NHS作為活化劑，將隱性孔雀石綠多克隆抗體以共價(jià)連接的方式固定到了修飾過(guò)的玻碳電極表面，BSA封閉，以減少非特異吸附對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。根據(jù)抗體抗原特異性反應(yīng)前后電極表面電阻值的變化對(duì)隱性孔雀石綠進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)限為0.03 n