舒巴坦酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及電化學(xué)免疫傳感器的研究.pdf

1、舒巴坦(Sulbactam，SBT)又稱青霉烷砜酸，是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，可與β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，使其失去活性，不能被檢出。2009年我國(guó)將在乳品中添加β-內(nèi)酰胺酶定義為違法行為，因此，不法分子在β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性乳品中添加舒巴坦，以逃避檢測(cè)。本研究依據(jù)免疫學(xué)基本原理，設(shè)計(jì)合成免疫原SBT-KLH，免疫動(dòng)物后獲得SBT多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立dcELISA與電化學(xué)免疫傳感器法檢測(cè)乳品中SBT，兩種快速檢測(cè)方法均有

2、較高的精確度、靈敏度與特異性。
　　SBT人工抗原的合成和抗體的制備。將鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)與卵清白蛋白(OVA)通過(guò)活潑酯法偶聯(lián)后，得到免疫原SBT-KLH與包被原SBT-OVA。采用SBT-KLH進(jìn)行動(dòng)物免疫程序，免疫完成后心臟取血獲得抗血清，經(jīng)ProteinA-Sepharose4B凝膠柱純化后，獲得SBT多克隆抗體。
　　dcELISA分析方法的建立。對(duì)ELISA反應(yīng)體系的包被抗體質(zhì)量濃度與酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)、封閉液

3、濃度、pH值、離子濃度以及包被條件進(jìn)行優(yōu)化后，在最適工作濃度下建立舒巴坦直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法，該方法在0.0001～10000ng/mL濃度范圍內(nèi)，IC50值為5.25ng/mL，最低檢測(cè)限可以達(dá)到1.07pg/mL。板內(nèi)、板間平均變異系數(shù)別為6.69％、9.02％，對(duì)結(jié)構(gòu)類似物他唑巴坦與克拉維酸的交叉反應(yīng)率分別為7.12％、0.93％，說(shuō)明該方法的穩(wěn)定性和特異性較好。選取牛奶、酸奶和奶粉三種樣品，研究基質(zhì)消除方法，測(cè)定加標(biāo)回收率。采

4、用TCA法處理樣品后，牛奶、酸奶稀釋至40倍，奶粉稀釋至20倍可以消除基質(zhì)效應(yīng)，樣品回收率在84.25％～90.11％之間;采用Careez法處理樣品時(shí)，牛奶、酸奶稀釋至10倍，奶粉稀釋至5倍可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，樣品回收率在80.83％～84.58％之間，采用HPLC法對(duì)ELISA法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，相關(guān)性良好，說(shuō)明本研究建立的乳品中SBT殘留檢測(cè)的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　基于羧基化單壁碳納米管/殼聚糖的間

5、接競(jìng)爭(zhēng)電化學(xué)免疫傳感器法。該方法利用超聲制得羧基化單壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜，滴涂在電極，再將SBT-OVA吸附到電極表面，樣品中的SBT與SBT-OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合滴涂在電極表面的SBT多克隆抗體。然后辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔結(jié)合到電極表面，辣根過(guò)氧化物酶催化底物，產(chǎn)生電信號(hào)，由電信號(hào)的變化對(duì)SBT進(jìn)行定量分析。對(duì)反應(yīng)體系優(yōu)化后，在1～100000ng/mL濃度范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.321ln(x)+12.282，R2為0.9918，