人SUMO2基因多克隆抗體的制備及其亞細胞定位的研究.pdf

1、小泛素相關(guān)修飾物SUMO(small ubiquitin related-modifier)與蛋白的共價連接是一種新的廣泛存在的翻譯后修飾形式。SUMO是廣泛存在于真核細胞中高度保守的蛋白家族，在脊椎動物中有4個SUMO基因，稱為SUMO1、SIJMO2、SUMO3和SUMO4。SUMO與泛素在二級結(jié)構(gòu)上極其相似，且催化過程的酶體系也具有很高的同源性。然而，與泛素化介導(dǎo)的蛋白酶降解途徑不同，SUMO化修飾發(fā)揮著更為廣泛的功能，如核質(zhì)運輸

2、、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等。近來的研究表明，SUMO化修飾還參與調(diào)控線粒體分裂、DNA損傷修復(fù)及調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性和調(diào)控離子通道。此外，SUMO化修飾功能的紊亂會導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。 在SUMO家族中，SUMO1屬于SUMO第一類家族，相關(guān)的研究報道比較多；而SUMO2屬于SUMO第二類家族，相關(guān)的研究還十分有限。本研究根據(jù)己發(fā)表的人SUMO2的基因序列設(shè)計了特異性引物，以重組質(zhì)粒pEYFP-SUMO2為模板，采用

3、PCR法對SUMO2基因進行亞克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET41a-SUMO2-SUMO2。將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)plysS中，篩選含重組質(zhì)粒的基因工程菌。重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到高效表達，其細胞裂解物用SDS-PAGE進行檢測。用GST親和層析法純化表達蛋白，經(jīng)SDS-PAGE方法及Western blotting檢測，分析純化的蛋白。用GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白按照常規(guī)的方法免疫健康家兔，

4、然后收集兔血清，用ELISA法測定抗血清的效價，用Western blotting檢測其特異性。用制得的SUMO2多克隆抗體對Hela細胞中內(nèi)源性的SUMO2表達進行了Western blotting檢測以驗證該抗體。此外，構(gòu)建了SUMO2的真核表達載體pCMV-HA—SUMO2(HA—S2)、pCMV-Myc-SUMO2(Mye-S2)、pEGFP-SUMO2(G—S2)和pDsRed—SUMO2(R-S2)，并初步觀察SUMO2的亞

5、細胞定位及其與其他調(diào)控因子的共定位情況。 結(jié)果表明，本研究成功地亞克隆了人SUMO2基因。所構(gòu)建的表達質(zhì)粒pET41a-SUMO2-SUMO2在BL21(DE3)plysS中成功表達了分子量約為52KDa的融合蛋白，與預(yù)測的大小一致。用抗血清作為一抗進行Western blotting檢測，結(jié)果表明此抗血清是針對人SUMO2的多抗。用抗血清作為包被抗體，用SUMO2作為檢測抗原，進行ELISA試驗，結(jié)果表明經(jīng)四次免疫后，抗體效