人胱抑素C抗體制備和檢測(cè)方法建立及其方法學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、胱抑素 C (cystatin C，Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，其血清濃度測(cè)定是優(yōu)于傳統(tǒng)的血尿素、尿酸、肌酐和內(nèi)生肌酐清除率測(cè)定的新的腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。2002年FDA網(wǎng)上公布了26個(gè)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)有重大突破的全新檢測(cè)項(xiàng)目，血清 (漿)Cys C測(cè)定便是其中之一。但目前臨床試驗(yàn)室測(cè)定Cys C均為需要昂貴特殊儀器和試劑盒的方法，制約了其推廣應(yīng)用。 目的： 構(gòu)建人Cys C的原核表達(dá)載體，將純化的Cys C重組蛋白免疫

2、大白兔，制備Cys C抗血清，為建立Cys C的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)；用自制的Cys C抗血清，建立可在自動(dòng)生化分析儀上定量測(cè)定血清Cys C的顆粒增強(qiáng)透射免疫分析法(particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)，并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，為該法的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；用純化的重組Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，制備Cys C單克隆抗體，為進(jìn)一步建立Cys C其他免疫學(xué)測(cè)定方法，以及研究Cys

3、 C的其他生物學(xué)作用和機(jī)制提供基礎(chǔ)。 方法： 1．采用RT-PCR技術(shù)，從細(xì)胞中擴(kuò)增Cys C目的基因，并將其克隆到 pET32a(+)原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組 Cys C 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/Cys C。 2．將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)蛋白經(jīng)鎳離子親和層析系統(tǒng)純化，并進(jìn)行鑒定。 3．用純化重組蛋白免疫大白兔，制備Cys C抗血清。 4．采用自

4、制提純的Cys C抗血清包被乳膠顆粒，建立可在自動(dòng)生化分析儀上定量測(cè)定Cys C的PETIA，并將此法與進(jìn)口商品化試劑盒進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以及進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、檢測(cè)限、干擾試驗(yàn)等方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)。 5．用純化重組的Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)過克隆化和篩選，建立穩(wěn)定分泌抗Cys C的雜交瘤細(xì)胞株，并通過動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水大量制備單克隆抗體。 結(jié)果：

5、 1．經(jīng)基因克隆及重組技術(shù)，獲得了35 kD的Cys C融合蛋白，其表達(dá)形式為不溶性包涵體，此包涵體蛋白經(jīng)Ni<'2+>親和層析能有效純化；以該蛋白免疫大白兔制備了Cys C抗血清。 2．采用自制提純的Cys C抗血清包被乳膠顆粒，建立了可在自動(dòng)生化分析儀上定量測(cè)定Cys C的PETIA，方法學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)顯示該法具有較好的檢測(cè)性能指標(biāo)，并與進(jìn)口的商品試劑盒有很好的可比性，符合臨床應(yīng)用要求。 3．采用雜交瘤技術(shù)，建立了穩(wěn)定

6、分泌抗Cys C單克隆抗體的 2 株雜交瘤細(xì)胞株，將其中 1 株細(xì)胞注射于小鼠腹腔，得到了富含Cys C單克隆抗體的小鼠腹水。 結(jié)論： 1．經(jīng)基因重組技術(shù)獲得了35 kD的Cys C融合蛋白，利用此蛋白抗原制備得到兔抗人Cys C抗血清(多克隆抗體)，并成功制備了鼠抗人Cys C單克隆抗體。 2．采用自制的Cys C抗血清，建立了在自動(dòng)生化分析儀上定量測(cè)定Cys C的PETIA，該法具有較好的性能指標(biāo)，與商品化進(jìn)