重組人β防御素4的原核表達、純化及抗銅綠假單胞菌活性初探.pdf

1、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa，PA)，是一種常見的院內獲得性感染條件致病菌，在自然界分布廣泛，具有極強的環(huán)境適應能力，它常常引起創(chuàng)傷及免疫受損機體的嚴重感染，也是燒傷患者極易發(fā)生感染的菌種之一，病死率較高，預防和治療銅綠假單胞菌感染已成為降低燒傷病人致殘率和病死率的主要措施。由于其能形成生物膜，以及對大多數的抗生素具有耐藥性使得其很難被徹底治療。特別是近期已經出現了對亞胺培南和全部第三代頭孢菌素及常用抗假

2、單胞菌藥物均耐藥的多重耐藥銅綠假單胞菌。針對銅綠假單胞菌耐藥性日益增強，而抗生素療效愈來愈下降的迫切現狀，如何研發(fā)更有效的藥物治療銅綠假單胞菌感染，已成為抗感染治療急待解決的問題。 人防御素是機體抵抗病原微生物入侵的第一道天然防線，是人體內重要的天然免疫物質；人防御素含40～50個氨基酸，是分子質量為4～5 kDa的陽離子短肽，精氨酸含量相對豐富，為非糖基化蛋白。分子內含有6個保守的半胱氨酸殘基，可形成3個典型的分子內二硫鍵，構

3、成3個穩(wěn)定的反向p片層結構；是一類具有廣譜抗微生物活性的小分子抗菌肽，具有抗菌、抗病毒及殺傷腫瘤細胞的多種效應。人β防御素4(human Beta defensin4)是由Wolf-Georg Forssmann于2001年發(fā)現，屬于β防御素，含有50個氨基酸，具有廣譜抗菌活性，尤其對耐藥性銅綠假單胞菌具有強大的殺菌作用。Yanagi研究表明在所有銅綠假單胞菌感染的病人中都可檢測到HBD2和HBD4表達，體外活性實驗結果也表明HBD2和

4、HBD4對銅綠假單胞菌有很強的殺傷活性，HBD4的殺傷活性更高，這些結果都表明在銅綠假單胞菌感染的過程中，HBD2和HBD4在機體的感染防御中發(fā)揮著重要作用：針對HBD4對銅綠假單胞菌高殺傷活性，臨床燒傷研究人員將HBD4基因導入皮膚細胞，使其能高表達HBD4以用來治療預防銅綠假單胞菌對燒傷皮膚的感染；結果表明，與普通皮膚細胞相比，該基因工程細胞對銅綠假單胞菌有很強的抑制性。HBD4天然產量非常低，而化學合成成本相當高，通過基因工程技術

5、生產防御素可滿足科研和開發(fā)新藥研究的需要，具有廣闊的應用前景。 由于抗菌肽對宿主的毒性，在E.coli系統(tǒng)中直接表達抗菌肽產量很低，且易受到宿主細胞蛋白酶的降解。融合表達或在酵母中表達是兩種解決方法，大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，已有好多陽離子肽在大腸桿菌中成功融合表達。鑒于以上的問題，我們選用了目前表達重組蛋白功能最強大的pET系統(tǒng)，并在目的蛋白N端融合谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)蛋白標簽，在大腸桿菌中

6、表達可溶性重組GST融合人β防御素4蛋白。為了獲得天然N端的β人防御素4蛋白，我們在GST標簽與人β防御素4蛋白之間添加了腸激酶(Enterokinase)酶切位點，以便融合蛋白純化后，通過腸激酶酶切釋放人β防御素4蛋白，最終獲得與天然人β防御素4蛋白氨基酸序列相同的重組人β防御素4蛋白。并對重組人p防御素4蛋白的活性進行了研究，測定其體外抗菌活性，本課題研究的主要內容和結果如下： 1.構建原核表達載體和優(yōu)化表達目標蛋白：我們以

7、人β防御素4基因為模版，通過PCR擴增人β防御素4基因，雙酶切后與載體pET-42a(+)連接，構建了重組質粒，并經基因測序證實結果正確，表明原核表達載體構建成功，重組質粒命名為pET42-HBD4。本研究選用的pET原核表達系統(tǒng)是目前在大腸桿菌(E.coli)中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)，蛋白表達由宿主菌提供的T7RNA聚合酶誘導，非誘導條件下則不存在基礎轉錄，從而使克隆與表達很好的分離。本實驗目的基因克隆到載體后，重組質粒首先

8、選用不含有T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)進行克隆，這就避免了對宿主細胞有毒的蛋白產物對質粒穩(wěn)定性的影響；完成克隆后，將其轉入染色體上帶有l(wèi)acU V5調控的T7RNA聚合酶基因的表達宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導表達，融合蛋白以可溶的形式表達。本實驗需要大量的目的蛋白用于后續(xù)實驗，因此，我們對表達條件也進行了優(yōu)化，最佳表達條件為：37℃誘導4h，IPTG濃度為0.5mmol/L。 2.重組GST-HBD4融

9、合蛋白的純化：本研究選用了固定化金屬離子親和層析法(IMAC)純化蛋白，它的優(yōu)點是金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性，吸附量大，成本低，純化時間短。實驗結果表明，鎳柱純化后，GST-HBD4融合蛋白的純度能達到90％以上。腸激酶酶切后，再用鎳柱純化HBD4蛋白，純度約為95％，透析脫鹽后，滿足后續(xù)測活實驗的要求。 3.重組人β防御素4外抗菌活性的研究：通過瓊脂擴散法初步測定了重組人β防御素4對銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色

10、葡萄球菌敏感株(ATCC25923)、大腸埃希菌(ATCC35218)、糞腸球菌(ATCC29212)的抗菌活性，發(fā)現其對銅綠假單胞菌活性最強，與報導一致。我們采用微量稀釋法測定了重組人β防御素4對銅綠假單胞菌的體外抗菌效力，結果證實，重組人β防御素4有較好的殺菌活性，其對銅綠假單胞菌的MIC和MBC都是小于哌拉西林和環(huán)丙沙星而略大于亞胺培南，提示其較前兩種傳統(tǒng)抗生素對銅綠假單胞菌在體外具有更好的殺菌活性。 綜上所述，我們成功構