光動力療法抗多重耐藥銅綠假單胞菌感染的研究.pdf

1、目的: 研究釕化合物對銅綠假單胞菌的光動力（Photodynamic therapy, PDT）殺傷作用，初步觀察其在體抗感染效果。
　　方法:
　　(1)銅綠假單胞菌ATCC27853、PAO1和3株臨床分離的PA1、PA2、PA3，配成108CFU/ml細(xì)菌懸液，將Ru光敏劑(PS)按不同濃度與其混合后孵育30 min，用波長457 nm激光，功率密度40 mW/cm2，照射時(shí)間10 min進(jìn)行PDT處理，另設(shè)完全空白、

2、單純光敏劑、單純照光對照組。各組在處理后采用稀釋平板法計(jì)數(shù)觀察PDT對浮游菌的殺傷作用。并電鏡觀察PDT后細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　(2)培養(yǎng)PAO1生物被膜，進(jìn)行PDT處理（照光參數(shù)同上）。處理后采用結(jié)晶紫染色光鏡觀察PAO1生物被膜結(jié)構(gòu)變化，MTT法檢測細(xì)菌活性。另設(shè)單純光敏劑、單純照光和完全空白對照組。以掃描電鏡觀察生物被膜經(jīng)PDT處理后超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　(3)測定加入外排泵抑制劑前后PDT對銅綠假單胞菌PA1和P

3、AO1的殺傷。根據(jù)加入PAβN和光敏劑的先后順序，分為單純PS、同時(shí)加入、先外排泵抑制劑(Efflux pump inhibitor, EPI)后PS和先PS后EPI組，PDT處理后，測定細(xì)菌活性。同時(shí)采用吸收光譜法檢測各組中與細(xì)菌結(jié)合的PS含量。
　　(4)采用膠帶撕脫法建立小鼠皮膚PAO1感染模型，將24只感染小鼠分為PDT和單純感染組，每組12只。PDT后即刻、24h剪取感染皮膚(n=6)，平板計(jì)數(shù)單位皮膚中的細(xì)菌數(shù)。PDT

4、后觀察大體變化，行病理組織學(xué)檢查(n=3)。
　　結(jié)果:
　　(1)不同濃度Ru-PDT對5株銅綠假單胞菌均有殺傷。光敏劑在濃度10μM時(shí)，5株銅綠假單胞菌活性均降低4 Log以上。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PDT后細(xì)菌內(nèi)外膜遭到破壞，胞內(nèi)容物從膜結(jié)構(gòu)上的裂縫中釋放。
　　(2)隨光敏劑濃度的增加，生物被膜內(nèi)細(xì)菌活性在PDT處理后降低。在相同PDT條件下，Ru-PDT對被膜內(nèi)細(xì)菌的作用較對浮游菌弱。25μ M-PDT處理可明顯破壞

5、生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性，清除菌體及胞外基質(zhì)。
　　(3)加入PAβN可增強(qiáng)PDT的作用效果。先加PAβN再加PS組PDT對細(xì)菌的殺傷作用最強(qiáng)，與細(xì)菌結(jié)合的光敏劑含量最高。先加PS再加PAβN時(shí)，PDT殺傷效果最差。
　　(4)PDT后細(xì)菌負(fù)荷明顯低于空白對照組(p＜0.01)，并達(dá)到了有效殺傷標(biāo)準(zhǔn)（細(xì)菌數(shù)降低＞3 Log）。24h時(shí)有細(xì)菌再生長現(xiàn)象，但PDT處理后24h細(xì)菌負(fù)荷仍然低于感染2h和24h組。PDT處理后小鼠皮膚創(chuàng)

6、面有明顯的縮小。
　　結(jié)論:
　　1.Ru-PDT具有殺傷銅綠假單胞菌的作用，其機(jī)制可能是通過破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的完整性引起胞質(zhì)成分外泄，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。
　　2.Ru-PDT具有殺傷銅綠假單胞菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌及破壞被膜的作用。PDT對生物被膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷比對浮游菌的殺傷弱。
　　3.外排泵抑制劑PAβN可以增強(qiáng)Ru-PDT作用，可能是通過抑制細(xì)菌外排泵，減少光敏劑排出菌體外而起作用。
　　4.PDT干預(yù)可有效殺