截短型重組蛋白HLA-G1的原核表達(dá)純化和共復(fù)性研究.pdf

1、人白細(xì)胞抗原(HLA-G)是一種非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類基因，與人免疫耐受相關(guān)。選擇性表達(dá)于母胎界面的絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，在誘導(dǎo)母體對(duì)半同種異體胎兒的妊娠免疫耐受起著重要作用。一些報(bào)道還發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞中有HLA-G高水平的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，從而推測(cè)HLA-G可能在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。相對(duì)于經(jīng)典的HLA-la類分子，HLA-G與其他非經(jīng)典的HLA-Ib類一樣在基因和蛋白水平上都表現(xiàn)出有限的多態(tài)性，目前已公布的HLA-G等位基因僅有16

2、種。HLA-G另一顯著特征就是其mRNA初始轉(zhuǎn)錄經(jīng)選擇性接切產(chǎn)生至少7種同種異型體，分別編碼4種膜結(jié)合型(HLA-G1-G4或mHLA-G1-G4)及3種可溶性HLA-G(HLA-G5-G7或sHLA-Gl-G3)。 利用已經(jīng)構(gòu)建好的克隆質(zhì)粒pGEM-T-HLA-G1，進(jìn)一步構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-sHLA-G1，表達(dá)出重組蛋白His-sHLA-G1，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化和鑒定。 β2微球蛋白(β2m)是主

3、要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅰ類分子的輕鏈部分，該蛋白的原核表達(dá)與純化是制備MHC-Ⅰ類分子的首要條件。利用已經(jīng)構(gòu)建好的人β2m(hβ2m)的原核表達(dá)載體pET23a-hβ2m，在大腸桿菌(E.coli)中獲得穩(wěn)定表達(dá)。原核表達(dá)的hβ2m大部分在包涵體中，包涵體蛋白經(jīng)充分洗滌、變性(脲溶解)和復(fù)性，并以強(qiáng)陰離子交換柱層析(Q-Sepharose)純化，獲得SDS-PAGE純的hβ2m，Western印跡法分析表明該蛋白具有與抗人天然β

4、2m抗體反應(yīng)的特性。 在最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，即：37℃，在含lmmol/L的IPTG的LB培養(yǎng)基中重組蛋白His-sHLA-G1和hβ2m分別誘導(dǎo)5h，3h，兩蛋白均以包涵體的形式得到了大量的表達(dá)。SDS-PAGE電泳顯示其分子量分別為36kD和12kD，與預(yù)期相符。在Westernblot免疫印跡分析，重組蛋白與87G單克隆抗體，hβ2m與其腹水多克隆抗體B2.62.2發(fā)生特異性反應(yīng)。重組蛋白His-sHLA-G1包涵體經(jīng)6

5、mol/L的脲溶解后用鈷離子樹(shù)脂純化，獲得理想的純化效果。hβ2m蛋白包涵體經(jīng)洗滌溶解和復(fù)性純化后也獲得較高的純度，滿足輔助重組蛋白His-sHLA-G1復(fù)性的要求。 重組蛋白His-sHLA-G1在與hβ2m稀釋法共復(fù)性，超濾濃縮后，在20μg/ml的濃度下，分別以NK92和K562細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，在5：1和2.5：1的效靶比例下，用乳酸脫氫酶法(LDH法)測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果表明20μg/ml重