腸球菌多重PCR方法的建立及不同來源腸球菌種屬分布和耐藥特點初探.pdf

1、腸球菌為重要的人獸共患條件致病菌，可引起人和動物多部位的感染。腸球菌也是我國院內(nèi)感染的重要病原菌之一，近年來，多重耐藥腸球菌、萬古霉素耐藥腸球菌（vancomycin-resistant Enterococci，VRE）的出現(xiàn)，對臨床腸球菌的感染控制提出了挑戰(zhàn)。
　　腸球菌屬包括近40個種，人類及哺乳動物消化道均普遍攜帶。不同種屬腸球菌的分布特征及藥物敏感性有很大差異，如鶉雞腸球菌、鉆黃腸球菌因攜帶天然萬古霉素耐藥基因vanC表現(xiàn)

2、出對萬古霉素固有耐藥。耐藥基因水平轉(zhuǎn)移是腸球菌耐藥性獲得的主要分子機制之一。不僅僅是人類機體，養(yǎng)殖動物、環(huán)境都可能作為腸球菌耐藥基因的儲存庫。因此了解不同來源腸球菌的種屬分布及其藥物敏感性特征將有助于研究耐藥腸球菌的流行規(guī)律和傳播途徑，幫助臨床更有效的預(yù)防和控制耐藥腸球菌的感染。
　　本課題對來自社區(qū)人群及養(yǎng)殖場動物（雞、豬）的糞便樣本進行腸球菌的分離培養(yǎng)，通過建立的腸球菌種屬鑒定的多重PCR方法對分離菌株進行種屬鑒定;采用紙片擴

3、散(disk diffusion method，K-B)法、瓊脂稀釋法對不同來源腸球菌進行抗菌藥物的敏感性檢測;應(yīng)用建立的腸球菌屬、常見腸球菌種及萬古霉素耐藥基因型檢測的多重PCR方法對VRE疑似菌株進行耐藥基因型檢測，以期初步闡述我國不同來源腸球菌的種屬分布及其藥物敏感性特征。
　　選擇包括腸球菌屬及6個腸球菌種（糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、鉆黃腸球菌、堅韌腸球菌、鳥腸球菌）在內(nèi)的特異性擴增引物，以16S rDNA特異性擴增

4、引物作為內(nèi)參，建立鑒定腸球菌屬及6個腸球菌種的8重PCR方法;選擇腸球菌屬、糞腸球菌、屎腸球菌、4個常見萬古霉素耐藥基因型（vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3）特異性擴增引物，以1對16S rDNA引物作為內(nèi)參建立用于腸球菌屬、常見腸球菌種及萬古霉素耐藥基因型檢測的8重PCR方法。經(jīng)過擴增產(chǎn)物多對特異性引物反復(fù)試驗，兩套8重PCR體系最終各選用最佳的8對特異性引物，準(zhǔn)確快速檢測腸球菌種屬及萬古霉素耐藥基因型。
　　對

5、220份社區(qū)人群及養(yǎng)殖場動物（雞、豬）的糞便樣本中腸球菌進行分離培養(yǎng)、種屬鑒定及藥物敏感性分析顯示:腸球菌總分離率為70.91％(156/220)，其中豬源樣本腸球菌分離率最高(86.00％)，人源樣本腸球菌分離率最低(62.63％)，且人源與豬源樣本腸球菌分離率差異顯著(P＜0.018）;人源糞便樣本中分離率最高的為屎腸球菌(31.36％)，雞源、豬源腸球菌中糞腸球菌分離率最高，分別為28.17％和32.00％;抗菌藥物敏感性結(jié)果顯示

6、腸球菌對多種藥物的耐藥率在人源、雞源、豬源3種來源間差異顯著(P＜0.05)，且3種來源腸球菌的多藥耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);人源腸球菌對紅霉素(69.35％)、環(huán)丙沙星(37.10％)、氨芐西林(19.35％)等抗菌藥物耐藥率較其他來源的腸球菌要高;雞源腸球菌對四環(huán)素(88.24％)、氟苯尼考(11.76％)、氯霉素(21.57％)等抗菌藥物耐藥率較其他來源的腸球菌要高;豬源腸球菌對抗菌藥物耐藥率總體較低，且其多藥耐藥率

7、(7.84％)也低于人源(35.48％)及雞源腸球菌(30.19％)。對41株動物源VRE疑似菌株種屬、耐藥表型、耐藥基因型研究顯示:37株菌為VRE，包括6株攜帶vanC1的鶉雞腸球菌和31株攜帶vanC2/C3的鉆黃腸球菌，全部對萬古霉素中介耐藥而對替考拉寧敏感，;4株菌為非VRE，對萬古霉素和替考拉寧均表現(xiàn)為敏感;未鑒定到種的腸球菌，未檢測到萬古霉素耐藥基因。
　　本課題成功建立了兩套多重PCR檢測方法，分別用于同時鑒定腸球