禽波氏桿菌外膜蛋白的提取及免疫原性的研究.pdf

1、禽波氏桿菌病是由禽波氏桿菌(Bordetella avium)引起家禽的一種高度接觸性傳染病。我國(guó)最早是由朱瑞良等在1990年初發(fā)現(xiàn)的，該病主要引起雞胚死亡、孵化率降低和雛雞急性死亡及成年雞的眼炎等。據(jù)報(bào)道該病在不同地區(qū)的感染率為10％～50％，患病雞群生長(zhǎng)遲緩，飼料報(bào)酬低，給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。 近年來(lái)，細(xì)菌細(xì)胞膜中的一種重要組成成分外膜蛋白(outer-membrane-protein，OMP)的免疫作用越來(lái)越受到科

2、技人員的關(guān)注，并進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)證明，OMP具有良好的免疫原性，不僅可刺激體液免疫，而且也可刺激細(xì)胞免疫作用。盡管我們課題組曾經(jīng)研究過(guò)禽波氏桿菌全菌苗的免疫效果，但由于全菌中與免疫無(wú)關(guān)的成分太多，可能影響主要免疫物質(zhì)的免疫作用，所以我們進(jìn)行了禽波氏桿菌OMP的提取工藝及其免疫原性的研究，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)禽波氏桿菌OMP亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究情況報(bào)告如下： 試驗(yàn)一：間接ELlSA檢測(cè)禽波氏桿菌抗體方法的建立及臨床應(yīng)用首次建立

3、了用禽波氏桿菌外膜蛋白作為包被抗原，檢測(cè)禽波氏桿菌抗體的間接EL工SA方法。試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件為：抗原的稀釋度為1：160(此時(shí)蛋白濃度為15μg/mL)；血清稀釋度為1：200；酶標(biāo)二抗稀釋度為1：4000；用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L，pH7.4)作包被液；選擇含1％BS5的PBST作封閉液和稀釋液；4℃、24h包被；37℃、3h封閉；血清反應(yīng)時(shí)間為60min；酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間為45min；底物反應(yīng)時(shí)間為20min。應(yīng)用該方法

4、檢測(cè)禽波氏桿菌陽(yáng)性血清，其靈敏度為平板凝集試驗(yàn)的200-400倍；應(yīng)用該方法臨床上進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，其靈敏度為平板凝集試驗(yàn)的3-4倍，而且還具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，較高的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)便，快速等特點(diǎn)。 試驗(yàn)二：禽波氏桿菌外膜蛋白提取及免疫原性的檢測(cè)為研究禽波氏桿菌OMP的免疫原性，本試驗(yàn)采用超聲波破碎、十二烷酰肌氨酸處理技術(shù)提取了禽波氏桿菌OMP，采用Bradford方法測(cè)定禽波氏桿菌OMP含量，進(jìn)行了SDS-PAGE

5、電泳檢測(cè)，然后制備油乳劑OMP免疫抗原，對(duì)1日齡雛雞分別以0.3mL(OMP90μg)、0.5mL(OMP150kg)、0.8mL(OMP240kg)的劑量頸部皮下接種。結(jié)果：禽波氏桿菌OMP含量為300P-g/mL；禽波氏桿菌OMP最佳免疫劑量為0.5mL/只；通過(guò)免疫抗體與攻毒保護(hù)相關(guān)性測(cè)試，抗體效價(jià)在1：2<'8>以上能抵抗致死量禽波氏桿菌的攻擊。據(jù)間接ELISA法檢測(cè)的抗體水平可知，抗體的持續(xù)時(shí)間足以保護(hù)雛雞避過(guò)易感日齡，試驗(yàn)發(fā)