SARS病人PBMCs噬菌體展示抗體庫及抑制性差減雜交庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)引起的以呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的全身系統(tǒng)性傳染病，經(jīng)常能夠引起急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome)而導(dǎo)致患者死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，截止到2003年7月，全球共發(fā)現(xiàn)可能的SARS病例

2、8098例，其中774人死亡，分布范圍遍布世界29個國家和地區(qū)。SARS不僅威脅到人們的健康和生命，而且給全球的社會、經(jīng)濟等很多方面也造成了非常深刻的影響，是一種對人類社會危害很大的惡性疾病。然而，迄今為止，人們尚沒有找到有效治療SARS的手段，并且對SARS的發(fā)病機理也缺乏了解。 SARS爆發(fā)期間，有一些醫(yī)生用康復(fù)病人的血清來治療危重病人取得了較明顯的效果。研究表明，SARS康復(fù)病人體內(nèi)普遍存在著中和抗體，而諸多的試驗也證明

3、中和抗體能夠有效的治療和預(yù)防SARS-CoV的感染?；诖?，本文利用噬菌體展示技術(shù)對中和抗體的篩選進行了探索。 對SARS發(fā)病機理的不了解直接阻礙了我們尋找有效治療SARS-CoV感染的手段。研究顯示，外周血單核細胞(PBMCs)能夠被SARS-CoV感染，并且淋巴細胞減少癥是存在于SARS病人中一個很普遍的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象說明，PBMCs(其中80-90％為淋巴細胞)是研究宿主對病毒感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)的一個比較好的實驗材料。本文

4、利用抑制性差減雜交技術(shù)對SARS康復(fù)病人PBMCs的基因表達變化進行了研究。 本論文的主要研究內(nèi)容如下： (1)從SARS康復(fù)病人PBMCs中分離RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴增出重鏈抗體可變區(qū)基因和輕鏈抗體可變區(qū)基因，利用Linker將兩類可變區(qū)基因聯(lián)系起來組成scFv，同噬菌體展示載體連接后，構(gòu)建了一個容量為10<'6-7>CFU的噬菌體展示單鏈免疫抗體庫。 (2)用原核表達載體重組表達具有中和

5、抗體誘導(dǎo)活性的SARS-CoV Spike蛋白的S1段，得到了以包涵體形式存在的重組蛋白，通過變復(fù)性，得到了可溶性的S1蛋白，經(jīng)免疫學鑒定，證明該重組蛋白能夠被SARS陽性血清特異性識別。 (3)利用重組表達的S1蛋白，對構(gòu)建的SARS噬菌體展示單鏈免疫抗體庫進行了淘選，發(fā)現(xiàn)利用現(xiàn)有的淘選方法很難得到ORF正確的陽性單克隆抗體。隨著淘選次數(shù)的增加，含全長插入片段的“全長片段克隆”的比例迅速下降，而其中含ORF正確的“全長片段克

6、隆”的比例下降的更快，對普遍存在的含不完全插入片段的“短片段克隆”進行了研究，表明其ORF均是錯誤的。對這一現(xiàn)象的產(chǎn)生原因進行了初步探索。 (4)利用抑制性差減雜交技術(shù)對SARS康復(fù)病人PBMCs的基因表達變化情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)與線粒體相關(guān)及與氧化還原作用相關(guān)的基因有明顯的表達升高。免疫分子ILlB和HLA-DPBl表現(xiàn)出相對明顯的表達上升，這同康復(fù)病人中普遍存在的較強的體液免疫反應(yīng)可能有關(guān)。最讓人感興趣的是在發(fā)病之后17—

7、19周，病人體內(nèi)仍然有病毒RNA的存在，這大大超過人們之前的預(yù)期。另外有一些在此前利用基因芯片、雙向電泳等手段進行的研究中所沒有報道過的基因也表現(xiàn)出非常明顯的表達上升。對SARS康復(fù)病人PBMCs還進行了薄層透射電鏡分析，發(fā)現(xiàn)其中線粒體的數(shù)目發(fā)生了統(tǒng)計意義上的升高，并且溶酶體樣顆粒明顯增多。對這一現(xiàn)象進行了探討、分析。 總之，本論文從臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)理論兩個方面對SARS進行了研究與探索，在研究過程中既發(fā)現(xiàn)了存在的問題，也得到了