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文檔簡介
1、我國是桃的發(fā)源地,具有豐富的種質(zhì)資源,按照果肉顏色,桃分為紅肉桃、白肉桃和黃肉桃等。紅肉桃果肉呈血紅色,有血桃之稱,品質(zhì)優(yōu)良,外觀誘人,為我國桃屬植物中的特色資源。紅肉桃花青苷生物合成受基因表達調(diào)控,并且具有時空表達差異特性。因此,關(guān)于紅肉桃果實著色相關(guān)的關(guān)鍵基因克隆以及生物信息學(xué)研究對從分子水平揭示紅肉桃花青苷生物合成的機理有重要意義。
本研究首先建立高質(zhì)量高豐度的紅肉桃果實cDNA文庫,為基因的分離克隆奠定基礎(chǔ);確定紅
2、肉桃果實花青苷合成相關(guān)的關(guān)鍵酶,克隆出7個紅肉桃果實花青苷生物合成的關(guān)鍵功能基因;采用RACE技術(shù)獲得1條花青苷生物合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因MYB轉(zhuǎn)錄因子,具體研究結(jié)果如下:
1.紅肉桃果實cDNA文庫的構(gòu)建
以改良的SDS法從紅肉桃品種‘膠州血桃’和‘大把擼’果肉中提取總RNA,分離純化富含PolyA的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,通過CHROMASPIN-400柱篩選出其中大于500bp的片段與載體
3、pDNR-LIB連接,最后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌ElectroMAXDH5α,構(gòu)建了兩個紅肉桃果肉的cDNA文庫。經(jīng)質(zhì)量檢測,‘大把擼’cDNA文庫庫容量約為1.20×107cfu/ml,‘膠州血桃’cDNA文庫庫容為5.00×107cfu/ml,平均插入片段長度為1.0kb~2.0kb之間,符合高質(zhì)量文庫的要求。說明文庫完整有效,可用于大規(guī)模EST序列測定及數(shù)據(jù)分析。
2.紅肉桃果實花青苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的鑒定
4、> 利用RT-PCR法克隆花青苷生物合成代謝相關(guān)基因,根據(jù)桃、李、梨和蘋果等果樹上的花青苷生物合成代謝相關(guān)同源基因的高度保守性,設(shè)計合成簡并引物。獲得了7個紅肉桃果實花青苷生物合成的關(guān)鍵功能基因片段,包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase),查爾酮合成酶(chalconesynthase),查爾酮異構(gòu)酶(Chalconeflavononeisomerase),黃烷酮羥化酶(flavanone3-hy
5、droxylase),二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol-4-reductaseprotein),花色素合成酶(Anthocyanidinsynthase),及無色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidindioxygenase)。并且也已獲得桃18srRNA基因片段,這為下一步利用實時定量PCR技術(shù)來分析花青苷合成代謝相關(guān)功能基因在紅肉桃果實不同發(fā)育時期中基因表達差異打下了基礎(chǔ)。
3.調(diào)節(jié)基因MY
6、B轉(zhuǎn)錄因子的分離
使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit,獲得1條花青苷生物合成相關(guān)調(diào)節(jié)基因MYB轉(zhuǎn)錄因子(PpMYB10,GenBank登錄號為GU936492),經(jīng)Blastn同源性檢索結(jié)果表明該基因與其他已報道的果樹MYB轉(zhuǎn)錄因子同源性分別為:歐洲李(Prunusdomesticasubsp,EU153579)97.4%,酸櫻桃(Prunuscerasus,EU153582)88%,與榅桲和歐
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