茶樹自交不親和類型的鑒定及相關基因克隆與表達分析.pdf

1、茶樹(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）屬山茶科山茶屬，為多年生異花授粉植物。茶樹具有高度雜合性，而且生殖周期較長，遺傳學中的純系自交、雜交等方法應用相當少，這也使得茶樹的遺傳學研究遠遠落后于其它經濟作物，從而使茶樹的遺傳學規(guī)律的研究受到阻礙。茶樹結實率低，自花授粉基本不育，表現(xiàn)出自交不親和性。因此，茶樹的自交不親和研究是茶樹遺傳育種中一個重要的基礎課題。
　　 本研究以茶樹為研究材料，從茶樹花粉的體外

2、保存與萌發(fā)條件、茶樹花粉管在自交和雜交后在花柱及在子房內的生長與受阻情況、茶樹自交后與雜交后cDNA-AFLP差異分析、茶樹持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶克隆與熒光實時定量方法的建立，與茶樹自交不親和相關的茶樹鈣依賴型蛋白激酶基因(CsiCDPK)的克隆與表達鑒定等幾個方面對茶樹的自交不親和機理類型與相關基因進行了研究，主要結果如下:
　　 1、選取H3BO4、Ca(NO3)2、PEG-4000、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇等碳源

3、和不同pH值作為參考因子對茶樹花粉的萌發(fā)進行研究，結果表明茶樹花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適液體培養(yǎng)基是:0.01％硼酸，0.05％ Ca(NO3)2，5％ PEG-4000，5％麥芽糖，pH值在5.0～6.0之間(緩沖液30 mmol·L-1 MES)。在此條件下的茶樹花粉萌發(fā)率為82.24％，花粉管生長長度為492μm。花粉保存于4℃5d內發(fā)芽率仍有59.67％，適合短期保存，使用液N2冷凍后-70℃保存180d后萌發(fā)率仍有60.24％

4、,適合長期保存。
　　 2、選取‘祁門種’、‘龍井長葉’、‘福鼎大白茶’及‘藪北’等茶樹品種間進行自交和雜交，授粉后不同時間對花柱組織及子房進行采樣，通過苯胺藍熒光染色觀察花柱，對茶樹子房的進行石蠟切片觀察。結果顯示，雜交與自交的花粉在授粉48h大多數(shù)花粉管均穿過花柱進入子房組織;但雜交的茶樹花粉管能順利進入子房，自交的花粉管則不能進入，僅停留在子房腔內。說明茶樹的自交不親和可能與原先設想的配子體自交不親和機理不同，可能屬于延遲

5、型自交不親和(LSI)或子房自交不親和(OSI)。
　　 3、以未授粉茶樹雌蕊為對照，比較異交授粉后與自交授粉后cDNA-AFLP差異表達，通過比較選擇差異條帶進行序列測定，并與Genbank中已知數(shù)據(jù)對比，對其中功能基因進行分析，初步統(tǒng)計評價，找出已知并可能與自交不親和相關的基因序列15條，其中與自交授粉相關或信號傳導相關較為密切的有鈣依賴型蛋白激酶，衰老相關蛋白，G蛋白和細胞周期蛋白等。
　　 4、參照擬南芥、龍眼和

6、豌豆的GAPDH保守區(qū)設計GAPDH上游與下游引物，經克隆，轉化，測序，比對，該片段的氨基酸序列與擬南芥、龍眼、豌豆的核苷酸序列的同源性分別為80％、83％、81％，利用3'和5'-RACE克隆了該基因全長，3-磷酸甘油醛脫氫酶基因在多種植物中表達穩(wěn)定，可以作為實時熒光定量PCR的內標基因使用。
　　 5、利用茶樹GAPDH為內標基因對cDNA-AFLP差異表達后的7個片段進行差異表達檢測，發(fā)現(xiàn)這7個片段均能在自交24h后在子房

7、中特異表達。從中挑選1個片段研究對象，從獲得的差異圖譜中，克隆得到一個與茶樹自交不親和相關的鈣依賴蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法擴增獲得其cDNA全長序列，將其命名為茶樹CsiCDPK(Camellia sinensis calcium-dependent protein kinase)基因。該基因cDNA序列全長2281bp，編碼760個氨基酸。用熒光實時定量PCR方法進一步研究該基因的功能，檢測其表達特異性，結果表明，該基因在