沙田柚配子體自交不親和花柱消減文庫的構(gòu)建及差異表達(dá)基因的分析.pdf

1、沙田柚（Citrus grandis var. Shatinyu Hort.）為廣西的名優(yōu)水果，屬典型的配子體自交不親和植物，是研究配子體自交不親和機(jī)理的好材料。然而嚴(yán)重的自交不親和使沙田柚必須通過人工授粉才能結(jié)果，增加了生產(chǎn)成本。因此，研究沙田柚的自交不親和機(jī)理具有重要生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值和理論意義。 本研究以沙田柚自、異交花柱為材料，構(gòu)建了沙田柚自交不親和花柱抑制性消減雜交（suppression subtractive hybri

2、dization，SSH）正反向cDNA文庫，并對表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）進(jìn)行了分析研究。 藍(lán)白斑檢驗(yàn)結(jié)果表明，正向SSH文庫重組率為95％，PCR檢測表明插入片段的平均長度250bp左右。隨機(jī)挑選文庫中的80個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，去除測序不好的EST，共獲得67條測序較好的序列，剔除37條重復(fù)序列以及去載體后少于100bp的序列，共得到差異EST序列30條。這些序列通過BLASTx和B

3、LASTn軟件對基因庫(GenBank)中的非冗余(non-redundant)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性檢索，其中23條通過BLASTx搜索具有明確的功能對比結(jié)果，根據(jù)預(yù)測的功能進(jìn)行GO(gene ontology)分類，結(jié)果表明：10條與催化活性相關(guān)，占43.48％；3條與酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)，占13.04％；2條與轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性相關(guān)，占8.70％；另與信號傳遞活性、運(yùn)輸、及生理學(xué)途徑相關(guān)的各1條，占4.35％；還有4條未作分類，占17.39％。

4、 此外，還有7條EST序列在BLASTx搜索中沒有得到功能比對結(jié)果，但通過BLASTn搜索，有1條與野生種三淺裂野牽牛的自交不親和S-位點(diǎn)序列（Ipomoea trifida DNA，self-incompatibility(S-) locus region,haplotype:S1）具有較高的同源性，其相似度均為88％。另1條EST序列與蘋果的S9-Rnase基因（Malus x domestica MdSFBB9-alpha

5、，S9-Rnase，MdSFBB9-beta genes，complete cds，Psi-SFBB9-alpha，Psi-SFBB9-beta pseudo genes）的相似度達(dá)89％，另有2條與Nicotiana benthamiana（煙草）isopentenyl /dimeth-ylallyl diphosphate isomerase（異構(gòu)酶） mRNA,partial cds及Arabidopsis thaliana(擬南

6、芥)LAS1 (Lanosterol synthase 1)；catalytic/lyase(裂解酶)(LAS1) mRNA,complete cds有較高的相似度，分別為85％和87％。 反向文庫中，隨機(jī)挑取的34個(gè)陽性克隆檢測后測序，去除測序不好的EST，共獲得質(zhì)量較好的EST序列27條，剔除重復(fù)的序列，共得到差異EST序列24條。這些序列通過BLASTx軟件對基因庫(GenBank)中的非冗余(non-redundant)

7、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性檢索，搜索后均有明確的功能對比結(jié)果，根據(jù)預(yù)測的功能進(jìn)行GO分類，結(jié)果表明：它們與催化活性及酶調(diào)節(jié)活性功能相關(guān)性最大,分別占29.17％,如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、幾丁質(zhì)酶、脯氨酸寡肽酶、組氨酸激酶等，其余的一些分別與細(xì)胞成分（占16.67％）、結(jié)合（占8.33％）以及生理學(xué)途徑（占4.17％）等相關(guān)。 綜合以上研究，意味著決定沙田柚配子體自交不親和的可能不僅僅是S等位基因，也許是許多影響因子綜合作用的結(jié)果。沙田柚配子