沙田柚花粉壁蛋白和酸柚花粉壁蛋白的比較.pdf

1、采摘沙田柚(Citrus grandis Var. Shatinyu Hort)以及野生酸柚(Citrus grandis L.)盛花期的雄花,將兩者的花粉放入冷的pH6.7、1%Nacl緩沖液{10%蔗糖、0.45mM Ca2+(Cacl2 ·6H2O)、1.63 mM B(H3BO3)},在 5min,10min,20min,30min,40min,50min,60min,3h等不同時(shí)間內(nèi)抽濾、提取其壁蛋白后直接透析除鹽,然后在紫外

2、分光光度計(jì)280nm下測(cè)定OD值。由于免去了研磨、緩沖液靜置提取、冷凍離心等步驟,因此大大縮短了材料的處理時(shí)間。不同時(shí)間取樣測(cè)定結(jié)果表明：(1)兩者花粉壁釋放的蛋白質(zhì)在40min內(nèi)隨提取時(shí)間的增加而增加,40min后不再繼續(xù)釋放,并保持一定的釋放量：沙田柚自40min后,花粉壁蛋白的釋放量一直保持在0.364 mg/ml的水平上；而酸柚自40min后,壁蛋白的釋放量一直保持在0.488 mg/ml的水平上。(2)5min提取的濾液中蛋白

3、含量已達(dá)全部釋放蛋白質(zhì)的一半以上,這同Lewis在月見(jiàn)草中的結(jié)果是一致的。(3)進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),酸柚花粉壁蛋白質(zhì)的釋放,無(wú)論在速度上,還是在量上,都比沙田柚的大。以酸柚花粉壁不同時(shí)間提取物為對(duì)照組,采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電聚焦(IEF-PAGE)、雙向電泳(IEF/SDS-PAGE)等電泳技術(shù)對(duì)沙田柚和酸柚花粉壁不同時(shí)間蛋白提取物進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)兩者不

4、同時(shí)間花粉壁滲出液經(jīng)非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,考馬斯亮藍(lán) R-250 染液染色,都可明顯分出7個(gè)區(qū)帶,并且,在Ⅴ區(qū),兩者共同出現(xiàn)譜帶A。所不同的是沙田柚5min蛋白提取液圖譜中已經(jīng)含有絕大部分蛋白譜帶,隨后,各時(shí)間提取液圖譜中的蛋白譜帶在此基礎(chǔ)上于各區(qū)中或增或減；而酸柚直到提取時(shí)間為40min時(shí),其圖譜中才基本上包含有絕大部分的蛋白譜帶,隨后的50min、60min、3h譜帶的分布就是在此基礎(chǔ)上有增有減,并且這種增減情

5、況主要發(fā)生在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ區(qū)間、Ⅶ區(qū)。(2)兩者花粉壁蛋白經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后都出現(xiàn)多條染色帶,經(jīng)與在同樣條件下電泳的標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較,并輔助 SPSS數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩者的SDS-PAGE圖譜分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)沙田柚不同時(shí)間提取液中所含的主要蛋白質(zhì)的分子量主要是分布于1、3、4、5等四個(gè)區(qū)間內(nèi)。而酸柚花粉壁則主要含有分子量位于2、4、5等三個(gè)區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)。(3)兩者的等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果表明,在pH8.0區(qū)域內(nèi)

6、、pH6.5~5.8、pH5.8~5.4、pH5.4~4.4之間,沙田柚與酸柚不同時(shí)間花粉壁蛋白提取液的IEF圖譜都具有共同的譜帶。所不同的是隨著提取時(shí)間的增加,沙田柚花粉壁的堿性蛋白增加,而<；WP=3>；酸柚既有堿性蛋白的增加,又有酸性蛋白的增加。(4)經(jīng)銀染法染色后的沙田柚和酸柚花粉壁蛋白圖譜,分辨率較高,可分辨出近100個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。兩者的蛋白質(zhì)格局完全不一樣,就pH值分布區(qū)域而言,沙田柚花粉壁的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)主要分布于pH

7、7.2-5.8之間,而酸柚的花粉壁蛋白質(zhì)斑點(diǎn)密集于pH8.0-6.5；pH5.4-3.95兩個(gè)區(qū)域范圍之間；就分子質(zhì)量分布區(qū)域而言,沙田柚花粉壁的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)主要密集于14.4Ku~43.0Ku,而酸柚在20.1Ku~43.0Ku和31.0Ku~97.4Ku兩個(gè)區(qū)域內(nèi)分布有較多的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。值得注意的是：沙田柚花粉壁蛋白在pH7.2~5.8范圍內(nèi)存在有很多小分子量的蛋白質(zhì),如a、b、c、d、e點(diǎn),其中有一點(diǎn)e落入花柱S-糖蛋白范圍內(nèi)(pH

8、6.2~9.5,MW 24KD~32KD),根據(jù)對(duì)S-核酸酶在不親和反應(yīng)中作用機(jī)制的兩種假說(shuō),它們很有可能與花粉S基因產(chǎn)物有關(guān)。這些電泳結(jié)果表明：(1)相似性可能反映花粉中可溶性蛋白的共同性；(2)明顯差異性反映了植物品種和基因的差異,可作為遺傳分析的一種附屬手段。此外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,討論了沙田柚和酸柚花粉壁蛋白的比較及其意義,同時(shí)也探討了花粉自交不親和性調(diào)控的可能的作用機(jī)制。以期為解釋沙田柚配子體自交不親和——花粉S基因產(chǎn)物作用機(jī)制提