通過(guò)MLPK，SLG基因調(diào)控表達(dá)控制甘藍(lán)自交不親和性的研究.pdf

1、自交不親和性是顯花植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，雌蕊的柱頭或者花柱可以辨別自體和異體花粉，阻止自體受粉而利于異花授粉，從而保持高度雜合性促進(jìn)遠(yuǎn)緣繁殖時(shí)產(chǎn)生的一種重要生殖機(jī)制。SI現(xiàn)象在顯花植物中非常普遍，生產(chǎn)中利用不同單倍型的自交不親和系進(jìn)行雜種配制，是蕓薹屬植物雜交育種的重要方式。甘藍(lán)作為世界上重要的十字花科蔬菜作物，也是我國(guó)秋冬季重要的葉菜類(lèi)蔬菜作物。自交不親和性是甘藍(lán)雜種生產(chǎn)的重要途徑，具有雜種優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)、選育易、周期短等優(yōu)點(diǎn)。目前，甘藍(lán)自

2、交不親和系的選育和繁殖主要采用蕾期人工剝蕾授粉，該方法操作麻煩、效率低、費(fèi)工費(fèi)時(shí)、制種成本高，大大降低了甘藍(lán)雜種生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何實(shí)現(xiàn)自交不親和系的簡(jiǎn)便繁殖成為甘藍(lán)育種家們一直期望解決的問(wèn)題。包括化學(xué)、物理、生物學(xué)及機(jī)械等方法被用于克服自交不親和以實(shí)現(xiàn)花期自交授粉。如花期噴灑一定濃度的Nacl溶液和硼酸，電刺激，高溫處理，混合花粉授粉，CO2處理，γ射線輻射，鋼刷授粉等。這些方法雖然能夠在一定程度上提高甘藍(lán)自交結(jié)實(shí)率，但是這些方

3、法操作復(fù)雜易使柱頭受傷，田間操作難度大。隨著自交不親和性遺傳機(jī)制及其分子機(jī)理越來(lái)越明晰，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，有望從根本上解決自交不親和的調(diào)控問(wèn)題。為進(jìn)一步研究自交不親和關(guān)鍵因子對(duì)自交不親和性的影響，開(kāi)發(fā)甘藍(lán)自交不親和性人工調(diào)控生物技術(shù)手段，本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將柱頭特異啟動(dòng)子SLR驅(qū)動(dòng)下的反義MLPK基因和在柱頭特異啟動(dòng)子SLG13驅(qū)動(dòng)下的SLGi基因?qū)胱越徊挥H和甘藍(lán)材料‘TF’，通過(guò)反義干擾MLPK基因和RNA干擾SLG基

4、因的表達(dá)，研究MLPK和SLG在自交不親和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的作用及功能，為解析MLPK和SLG基因參與蕓薹屬SI信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制提供直接或間接的試驗(yàn)證據(jù)。另外，將Cre/loxp重組系統(tǒng)和AlcR/alcA乙醇誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建了一套基于乙醇誘導(dǎo)表達(dá)的甘藍(lán)自交不親和性人工調(diào)控系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)自交不親和系的簡(jiǎn)便繁殖和F1制種應(yīng)用。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艠?gòu)建了以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCABarMLPK，通過(guò)農(nóng)桿

5、菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入自交不親和甘藍(lán)‘TF’中?；ㄆ谥^MLPK基因的表達(dá)顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株花期柱頭內(nèi)源MLPK mRNA積累量明顯低于野生型對(duì)照植株?；ǚ墼幻劝l(fā)的熒光顯微觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株花期自交后，吸附在柱頭上的花粉粒大量萌發(fā)，且穿過(guò)柱頭的花粉管明顯增加，并導(dǎo)致花期自交結(jié)籽數(shù)量上升，轉(zhuǎn)基因植株花期和蕾期自交親和指數(shù)均明顯高于野生型對(duì)照植株。試驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)MLPK基因表達(dá)能部分打破甘藍(lán)自交不親和，提高其花期自交結(jié)籽能力。<

6、br>　?、仆ㄟ^(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將pCABarSLGi載體導(dǎo)入高度自交不親和甘藍(lán)材料‘TF’?；ǚ墼幻劝l(fā)熒光顯微觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株花期自交授粉后大量花粉粒被吸附于柱頭表面并萌發(fā)，可見(jiàn)明顯的花粉管束穿過(guò)柱頭，導(dǎo)致花期自交結(jié)籽數(shù)量增加，其花期自交親和指數(shù)在1.03～13.96之間，顯著高于花期自交親和指數(shù)為0.06的野生型對(duì)照植株。熒光定量PCR分析顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株花期柱頭中的SLG基因mRNA積累量顯著低于非轉(zhuǎn)基因野生型植

7、株。結(jié)果表明，干擾內(nèi)源SLG基因的表達(dá)，對(duì)打破甘藍(lán)自交不親和性有積極作用，可導(dǎo)致花期自交結(jié)籽能力大幅度上升。
　?、菍⒔M合有Cre/loxp重組系統(tǒng)和AlcR/alcA乙醇誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)以及SLGi干擾結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體pCABaralcRSLGi，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入高度自交不親和甘藍(lán)材料‘TF’?；ǚ墼幻劝l(fā)熒光顯微觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株花期白交可見(jiàn)大量花粉粒被吸附于柱頭表面并大量萌發(fā)形成花粉管束穿過(guò)柱頭。轉(zhuǎn)基因植株花

8、期自交后親和指數(shù)在0.66～14.7之間，均顯著高于野生型對(duì)照植株。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株在花期柱頭中的SLG基因mRNA積累量顯著低于非轉(zhuǎn)基因野生型植株mRNA積累量，并可在柱頭中檢測(cè)到alcR基因的表達(dá)。對(duì)pCABaralcRSLGi-5 T1代轉(zhuǎn)基因植株用1％～5％濃度的乙醇進(jìn)行灌根處理，顯示5％濃度的乙醇誘導(dǎo)能夠高效刪除SLG-RNAi基因干擾表達(dá)盒。進(jìn)一步對(duì)5個(gè)不同的pCABaralcRSLGi轉(zhuǎn)基因單株后

9、代群體利用5％的乙醇處理三次，結(jié)果顯示，僅17號(hào)單株T1代植株獲得高達(dá)60％的刪除效率，其余單株后代在同樣處理?xiàng)l件下刪除效率較低，刪除不完全導(dǎo)致嵌合體產(chǎn)生?；趐CABaralcRSLGi-5的后代單株乙醇誘導(dǎo)后Bar基因、alcR基因以及Cre基因表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化結(jié)果顯示，隨著乙醇誘導(dǎo)時(shí)間的增加，Bar基因mRNA積累量逐漸增加，而alcR基因因不斷刪除，其mRNA積累量逐漸下降，與此同時(shí)，Cre基因的mRNA在乙醇施加初期大量積