琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交不親和性觀察及相關(guān)基因克隆.pdf

1、自交不親和性(self-incompatibility SI)是顯花植物特有的抑制自體花粉受精的一種能力。在自交不親和性系統(tǒng)中，遺傳上由單一位點(diǎn)控制的，這一位點(diǎn)稱為S-locus。目前，分子水平顯示有三種類型：孢子體型自交不親和和兩種不同的配子體型自交不親和。 琯溪蜜柚和度尾蜜柚癟籽也是由于自交不親和性引起的，為此，本論文對(duì)兩品種自交不親和性進(jìn)行了課題研究和討論。內(nèi)容包括： 1、用熒光顯微技術(shù)對(duì)琯溪蜜柚(Citrus g

2、randis cv．Guanxi．pomelo)和度尾蜜柚(Citrus grandis cv．Duwei pomelo)自交和互交親和性進(jìn)行了觀察。發(fā)現(xiàn)兩品種自交和互交花粉在柱頭都萌發(fā)正常。但自交花粉管在進(jìn)入柱頭組織后，大部分花粉管在伸長過程出現(xiàn)破裂，伴隨有內(nèi)容物滲出，在花柱道內(nèi)緣有胼胝質(zhì)出現(xiàn)，但仍有部分花粉管能正常生長進(jìn)入子房，并從胚柄處進(jìn)入胚珠，在珠心組織里，觀察到胼胝質(zhì)的積累，其中大多數(shù)琯溪蜜柚和少數(shù)度尾蜜柚胚珠的胚囊位置出現(xiàn)強(qiáng)

3、烈的熒光亮點(diǎn)。而互交的胚珠中沒有觀察到這些現(xiàn)象。由此可見，兩品種的自交組合在花粉管進(jìn)入柱頭組織后直至進(jìn)入子房、胚珠的整個(gè)伸長過程中，存在一系列的不親和反應(yīng)。 2、對(duì)兩品種花粉在雌蕊不同部位抽提液中萌發(fā)和伸長狀態(tài)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交不親和識(shí)別和阻抑部位主要存在于子房，柱頭僅有輕度的自交不親和識(shí)別反應(yīng)和阻抑作用。這與報(bào)道的其他自交不親和柚類自交不親和識(shí)別和阻抑部位表現(xiàn)在花柱不相一致。 3、分別將雌蕊的

4、柱頭、花柱和子房進(jìn)行短截，移植到培養(yǎng)基上進(jìn)行播種花粉，以觀察雌蕊的不同部位對(duì)花粉的萌發(fā)和花粉管伸長的影響。實(shí)驗(yàn)表明在花粉在三個(gè)部位都能正常萌發(fā)和伸長，在花柱組織中同樣沒有異樣出現(xiàn)；琯溪蜜柚和度尾蜜柚花粉在本品種子房里出現(xiàn)了相似的強(qiáng)烈不親和反應(yīng)；并且琯溪蜜柚胚囊中有強(qiáng)烈的亮點(diǎn)出現(xiàn)。說明子房是兩品種自交不親和的主要區(qū)域，胚囊仍是與溪蜜柚的抑制部位，導(dǎo)致了琯溪蜜柚的不正常受精。 4、采用石蠟切片技術(shù)對(duì)琯溪蜜柚和度尾蜜柚自交和互交胚珠發(fā)

5、育進(jìn)行了比較觀察。琯溪蜜柚的自交授粉后胚珠發(fā)育有兩種不同情形(Ⅰ型和Ⅱ型)，Ⅰ型在授粉后5d的珠心組織細(xì)胞有變形現(xiàn)象，接著胚囊萎縮，但外珠被能生長發(fā)育到50d左右；Ⅱ型受精后胚乳發(fā)育異常，種子不能發(fā)育。度尾蜜柚自交胚囊中胚乳沒有出現(xiàn)，在授粉后35d左右珠心組織和囊腔同時(shí)萎縮?；ソ慌咧榘l(fā)育正常，成熟果實(shí)有籽。表明兩品種是自交不親和的，導(dǎo)致了果實(shí)無籽。但兩者的識(shí)別反應(yīng)和阻抑部位不同，琯溪蜜柚Ⅰ型可能出現(xiàn)在受精前，Ⅱ型出現(xiàn)在受精后，而度尾蜜柚

6、自交花粉管可能沒有進(jìn)入胚囊，是一種受精前的障礙。癟籽的大小與不親和障礙發(fā)生的時(shí)期有關(guān)。 5、為了在琯溪蜜柚中發(fā)掘自交不親和性相關(guān)基因，通過抑制差減雜交(SSH)的方法，以自交后的雌蕊的cDNA為tester，花粉為driver，建立了一個(gè)差減cDNA文庫。選定80個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果42個(gè)克隆測(cè)序成功，即得到42個(gè)獨(dú)立的(unique)ESTs序列。42個(gè)ESTs通過Blast比較分析，發(fā)現(xiàn)有23個(gè)ESTs與已知的geneban

7、k中mRNA序列有很高的同源性，并由此分為16個(gè)功能組，其中有4個(gè)與已經(jīng)報(bào)道的與自交不親和有關(guān)的基因：鈣依賴蛋白激酶(CDPK，CGDH2035)、磷酸酶(CGDF107)、肌醇—磷酸合成酶(CGF2030、CGF2011)、GTP酶結(jié)合蛋白(CGS10601)。除此之外，從差減文庫中還獲得一些未知基因。 所以，下一步的工作就是要鑒定那些基因是與柚自交不親和性有關(guān)，并克隆這些cDNA的全長基因，這不僅對(duì)于我們了解柚自交不親和性反