甘藍(lán)型油菜自交不親和恢復(fù)機(jī)理研究及應(yīng)用.pdf

1、自交不親和性是植物進(jìn)化出的一種防止自交衰退、促進(jìn)異交以更好地適應(yīng)環(huán)境的遺傳機(jī)制，在研究和應(yīng)用兩方面均具有重要意義。自交不親和是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑。栽培的甘藍(lán)型油菜(AACC)表現(xiàn)為自交親和，但是人工合成的甘藍(lán)型油菜及其兩個(gè)基本種白菜(AA)和甘藍(lán)(CC)卻是自交不親和的。本研究以人工創(chuàng)建的甘藍(lán)型油菜自交不親和系‘S-1300'，自然存在的親和甘藍(lán)型油菜‘10-9-8400'和‘Westar'等為材料，通過遺傳分析、基因克隆、表達(dá)

2、分析、啟動(dòng)子序列分析、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等研究手段對(duì)甘藍(lán)型油菜自交親和/不親和的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，初步揭了示油菜自交親和的原因，為研究油菜花粉-柱頭互作的分子機(jī)理打下了基礎(chǔ)。同時(shí)本研究還創(chuàng)建了鑒別S單倍型的分子標(biāo)記體系，用于選育自交不親和雜種，將提供育種效率、加快育種進(jìn)程。主要結(jié)果如下:
　　1.‘S-1300'自交不親和性的遺傳分析
　　鑒定‘S-1300'和‘10-9-8400'的S單倍型組成發(fā)現(xiàn)，他們?cè)贑基因組上含

3、有共同的S單倍型BnS-6，而A基因組不同，分別為BnS-1300和BnS-1。分析‘S-1300×10-9-8400'分離群體植株S位點(diǎn)基因型和表現(xiàn)型，證明‘S-1300'A基因組上的S單倍型BnS-1300決定其自交不親和性，來源于BrS-60。
　　2.同源序列法克隆‘S-1300'A基因組S位點(diǎn)基因
　　根據(jù)白菜BrS-60的序列設(shè)計(jì)引物，克隆S單倍型BnS-1300上的自交不親和基因。發(fā)現(xiàn)BnSP11-1300全長(zhǎng)

4、為378bp，包括兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與BrSP11-60具有100％的序列相似性。BnSRK-1300長(zhǎng)度為7967bp，包含7個(gè)外顯子與6個(gè)內(nèi)含子，與BrSRK-60的CDS序列具有100％的相似性，但是在內(nèi)含子1，內(nèi)含子3與內(nèi)含子5卻分別有數(shù)個(gè)堿基的差異。BnSP11-1300與BnSRK-1300均只在花蕾中、而不在根、莖、葉和角果中表達(dá)，符合蕓薹屬自交不親和基因的表達(dá)特點(diǎn)。
　　3.自交不親和分子標(biāo)

5、記體系的建立
　　克隆了恢復(fù)系‘10-9-8400'A基因組BnSRK-1的全長(zhǎng)CDS序列和BnSP11-1全長(zhǎng)序列。分析本研究得到的‘S-1300'和‘10-9-8400'以及本實(shí)驗(yàn)室已有的保持系‘Bing409'S位點(diǎn)基因序列，開發(fā)分子標(biāo)記。標(biāo)記SRK1-1和SCR1-1只在恢復(fù)系‘10-9-8400'中擴(kuò)增，標(biāo)記SRK-1300只在自交不親和系‘S-1300'中擴(kuò)增，標(biāo)記SCR7-2只在保持系‘Bing409'中擴(kuò)增。優(yōu)化P

6、CR反應(yīng)體系得到了兩個(gè)多重PCR分子標(biāo)記SRK-1300/SRK1-1及SRK-1300/SCR7-2。這些標(biāo)記在91份甘藍(lán)型油菜自交親和品系極其與‘S-1300'的雜種中得到了驗(yàn)證。
　　4.BnSP11-1啟動(dòng)子區(qū)Helitron轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)及進(jìn)化分析
　　發(fā)現(xiàn)油菜品系‘Westar'A基因組上BnSP11-1基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)3.6kb長(zhǎng)的片段為一個(gè)非自主的Helitron轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子只出現(xiàn)在帶有BnS-1的油菜中

7、。通過比對(duì)其在轉(zhuǎn)座過程中帶入的基因組片段，我們?cè)贐rS-47的SP11基因下游發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)Helitron轉(zhuǎn)座子，但是在油菜的BnS-1上卻沒有這個(gè)轉(zhuǎn)座子。由于BnS-1來源于BrS-47，同時(shí)兩個(gè)轉(zhuǎn)座子有相同的邊界序列，相同的3'末端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)在甘藍(lán)型油菜的形成過程中，Helitron轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)改變了油菜的授粉方式（由異花授粉變?yōu)槌．惢ㄊ诜郏瑥亩乖撐锓N能保存下來并對(duì)油菜的進(jìn)化產(chǎn)生重大影響。
　　5.BnSP11-

8、1基因啟動(dòng)子順式元件的鑒定
　　去掉Helitron轉(zhuǎn)座子的BnSP11-1基因啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因特異地在成熟花藥中表達(dá)。進(jìn)一步通過兩輪的啟動(dòng)子缺失分析，發(fā)現(xiàn)BnSP11-1基因啟動(dòng)子有多個(gè)順式元件協(xié)同作用控制著SP11基因的時(shí)空特異性表達(dá)，其中最主要的一個(gè)順式元件被發(fā)現(xiàn)位于-227bp到-217bp(5'-TTCTAGGGAT-3')的區(qū)域。
　　6.基因BnSP11-1的功能互補(bǔ)分析
　　通過轉(zhuǎn)基因手段將功

9、能完整的BrSP11-47基因?qū)氲接筒似废怠甒estar'中，得到了自交不親和的甘藍(lán)型油菜。授粉實(shí)驗(yàn)表明，野生型‘Westar'的柱頭能接受自身的花粉，但拒絕轉(zhuǎn)基因材料的花粉。這些結(jié)果再次證明了SP11基因失活導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜自交親和。
　　7.柱頭親和/不親和反應(yīng)的RNA-seq分析
　　利用野生型‘Westar'柱頭針對(duì)自身花粉與轉(zhuǎn)基因花粉的不同授粉特性，提取授以不同花粉柱頭的RNA，對(duì)柱頭親和和不親和反應(yīng)進(jìn)行RNA-s