茶樹中茶氨酸合成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證研究.pdf

1、茶氨酸（γ-N-乙基-谷氨酰胺）是茶樹中特有的游離氨基酸，也是茶葉中生津潤(rùn)甜的主要成分，對(duì)人體具有降血壓、改善睡眠、提高免疫力等生理作用。
　　茶氨酸作為一種一般認(rèn)為安全的成分被廣泛應(yīng)用于食品與藥用行業(yè)，傳統(tǒng)上通過(guò)茶葉天然提取純化獲得，然而該方法生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低。茶氨酸也可來(lái)源于化學(xué)合成，但存在產(chǎn)品D,L異構(gòu)體比例以及安全性評(píng)價(jià)等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)欠缺等弊端,難以被消費(fèi)者所接受。近年來(lái)，通過(guò)微生物發(fā)酵生物合成茶氨酸發(fā)展迅速

2、。
　　與其他植物不同，茶氨酸合成代謝與茶樹氮代謝密切相關(guān)，其合成途徑中主要的酶包括茶氨酸合成酶、丙氨酸脫羧酶、谷氨酸合酶及谷氨酰胺合成酶等。目前茶氨酸合成酶報(bào)道較少，日本Yukitata等從茶樹的cDNA文庫(kù)中篩選出兩條序列，經(jīng)原核表達(dá)純化蛋白后，證實(shí)具有合成茶氨酸活性。這兩條序列在氨基酸水平上與谷氨酰胺合成酶同源性高達(dá)90％，推測(cè)極有可能與谷氨酰胺合成酶同屬一個(gè)基因家族。另外利用其他物種的某些酶通過(guò)轉(zhuǎn)基因生物發(fā)酵后同樣也能產(chǎn)生

3、茶氨酸，這些酶包括谷氨酰胺合成酶、谷氨酰甲胺合成酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等。因此，茶樹中茶氨酸到底是谷氨酰胺合成酶或γ-?；D(zhuǎn)移酶等在特定的條件下合成還是由專一茶氨酸合成酶合成還有待進(jìn)一步研究。
　　本文以茶樹幼根cDNA文庫(kù)篩選出的與茶氨酸合成高度相關(guān)的兩條基因（CsGS1-1,CsGS1-2）以及從茶樹基因組得到的一條谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（CsGGT）為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)CsGS1-1、CsGS1-2、CsGGT進(jìn)行在大腸桿菌中表達(dá)，對(duì)GS

4、1-1進(jìn)行在大豆發(fā)根中表達(dá)，及對(duì)CsGS1-2進(jìn)行在釀酒酵母中表達(dá)，并酶活分析，探索茶氨酸合成的分子機(jī)制。具體研究結(jié)果如下：
　　1.從茶根中克隆得到的CsGS1-1，運(yùn)用Infusion技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)在大腸桿菌中表達(dá)飼喂底物后進(jìn)行酶活分析，其UPLC-MS-MS結(jié)果顯示在其培養(yǎng)液能檢測(cè)到茶氨酸生成，而對(duì)照組（載體未攜帶CsGS1-1）沒(méi)有檢測(cè)到茶氨酸，由此推斷該基因很有可能具有合成茶氨酸的功能。
　　2.從茶根中

5、克隆得到CsGS1-2，運(yùn)用Gateway技術(shù)構(gòu)建其酵母表達(dá)載體，經(jīng)在釀酒酵母中表達(dá)和酶活檢測(cè)，其UPLC-MS-MS結(jié)果顯示攜帶該基因的處理組谷氨酰胺產(chǎn)量約是對(duì)照組的2倍多，表明該基因表達(dá)產(chǎn)物具有谷氨酰胺合成酶功能，但不具有茶氨酸合成酶功能。
　　3.運(yùn)用Infusion技術(shù)成功構(gòu)建CsGS1-2在大腸桿菌中的表達(dá)載體，SDS-PAGE檢測(cè)了蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了表達(dá)總蛋白有一部分可溶性蛋白存在，可為體外酶活檢測(cè)做準(zhǔn)備。
　　此