茶樹中茶氨酸合成相關基因的功能驗證研究.pdf

1、茶氨酸（γ-N-乙基-谷氨酰胺）是茶樹中特有的游離氨基酸，也是茶葉中生津潤甜的主要成分，對人體具有降血壓、改善睡眠、提高免疫力等生理作用。
　　茶氨酸作為一種一般認為安全的成分被廣泛應用于食品與藥用行業(yè)，傳統(tǒng)上通過茶葉天然提取純化獲得，然而該方法生產成本高、生產周期長、生產效率低。茶氨酸也可來源于化學合成，但存在產品D,L異構體比例以及安全性評價等基礎數(shù)據(jù)欠缺等弊端,難以被消費者所接受。近年來，通過微生物發(fā)酵生物合成茶氨酸發(fā)展迅速

2、。
　　與其他植物不同，茶氨酸合成代謝與茶樹氮代謝密切相關，其合成途徑中主要的酶包括茶氨酸合成酶、丙氨酸脫羧酶、谷氨酸合酶及谷氨酰胺合成酶等。目前茶氨酸合成酶報道較少，日本Yukitata等從茶樹的cDNA文庫中篩選出兩條序列，經(jīng)原核表達純化蛋白后，證實具有合成茶氨酸活性。這兩條序列在氨基酸水平上與谷氨酰胺合成酶同源性高達90％，推測極有可能與谷氨酰胺合成酶同屬一個基因家族。另外利用其他物種的某些酶通過轉基因生物發(fā)酵后同樣也能產生

3、茶氨酸，這些酶包括谷氨酰胺合成酶、谷氨酰甲胺合成酶、γ-谷氨酰轉肽酶等。因此，茶樹中茶氨酸到底是谷氨酰胺合成酶或γ-?；D移酶等在特定的條件下合成還是由專一茶氨酸合成酶合成還有待進一步研究。
　　本文以茶樹幼根cDNA文庫篩選出的與茶氨酸合成高度相關的兩條基因（CsGS1-1,CsGS1-2）以及從茶樹基因組得到的一條谷氨酰轉肽酶（CsGGT）為研究對象，通過對CsGS1-1、CsGS1-2、CsGGT進行在大腸桿菌中表達，對GS

4、1-1進行在大豆發(fā)根中表達，及對CsGS1-2進行在釀酒酵母中表達，并酶活分析，探索茶氨酸合成的分子機制。具體研究結果如下：
　　1.從茶根中克隆得到的CsGS1-1，運用Infusion技術構建原核表達載體，經(jīng)在大腸桿菌中表達飼喂底物后進行酶活分析，其UPLC-MS-MS結果顯示在其培養(yǎng)液能檢測到茶氨酸生成，而對照組（載體未攜帶CsGS1-1）沒有檢測到茶氨酸，由此推斷該基因很有可能具有合成茶氨酸的功能。
　　2.從茶根中

5、克隆得到CsGS1-2，運用Gateway技術構建其酵母表達載體，經(jīng)在釀酒酵母中表達和酶活檢測，其UPLC-MS-MS結果顯示攜帶該基因的處理組谷氨酰胺產量約是對照組的2倍多，表明該基因表達產物具有谷氨酰胺合成酶功能，但不具有茶氨酸合成酶功能。
　　3.運用Infusion技術成功構建CsGS1-2在大腸桿菌中的表達載體，SDS-PAGE檢測了蛋白表達，發(fā)現(xiàn)了表達總蛋白有一部分可溶性蛋白存在，可為體外酶活檢測做準備。
　　此