蘋果多胺和脯氨酸合成代謝相關(guān)基因的功能鑒定.pdf

1、多胺不僅調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，還參與逆境響應(yīng)，而脯氨酸則是一種重要的滲透保護(hù)物質(zhì)。多胺和脯氨酸的生物合成代謝由一系列酶催化完成，如多胺生物合成途徑中的精氨酸脫羧酶（ADC）和精胺合成酶（SPMS），脯氨酸代謝中的重要酶△1-吡咯琳-5-羧酸脫氫酶（P5CDH）等。為研究多胺和脯氨酸合成代謝的分子機(jī)理，本研究從‘Gala’蘋果中克隆了MdADC、MdACL5、MdSPMS和MdP5CDH基因，其中MdADC編碼ADC，MdACL5和MdSP

2、MS均編碼SPMS，MdPSCDH編碼P5CDH，通過基因表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因功能鑒定等方法，鑒定了這些基因的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.克隆了MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的cDNA全長，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-MdADC、pBI121-MdSPMS和pBI121-MdACL5，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將它們分別導(dǎo)入煙草Nc89，獲得了各基因的轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2.半定量RT-PCR分析和高效液

3、相色譜（HPLC）測(cè)定表明MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的過量表達(dá)均導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)源多胺含量增加，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出植株矮化、節(jié)間縮短和葉面積增大等表型。
　　 3.非生物脅迫抗性分析發(fā)現(xiàn)，MdADC、MdSPMS和MdACL5轉(zhuǎn)基因煙草均對(duì)PEG、低溫和鹽等脅迫表現(xiàn)高抗。在三種脅迫下，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，各轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)出更高的多胺含量、脯氨酸含量、抗氧化酶（SOD、POD和CAT等）活性、根系活力以及更低的MD

4、A含量和相對(duì)電導(dǎo)率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與MdACL5相比，MdSPMS轉(zhuǎn)基因煙草的相關(guān)表型及抗性更明顯。
　　 4.從蘋果中克隆分離出了MdP5CDH基因的cDNA全長；半定量RT-PCR分析表明，該基因在蘋果各組織器官中組成型表達(dá)，開放花中表達(dá)最高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)。
　　 5.構(gòu)建了MdPSCDH基因標(biāo)簽蛋白大小不同的原核表達(dá)載體pET-30a-MdP5CDH和pGEX-MdP5CDH，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別得到6

5、5.14 kDa和88.44 kDa特異蛋白產(chǎn)物，確定該基因編碼蛋白大小為61.74 kD。
　　 6.構(gòu)建了MdP5CDH的正義表達(dá)載體pJIT166-MdP5CDH和反義抑制載體pBI121-RevMdP5CDH，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將它們分別導(dǎo)入‘王林’愈傷組織。半定量RT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)正義基因的愈傷組織中MdP5CDH過量表達(dá)，而轉(zhuǎn)反義基因的愈傷組織中MdP5CDH表達(dá)受抑制。
　　 7.MdP5CDH過量表