高溫脅迫條件下紫花苜蓿抑制消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與初步分析.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是在世界范圍內(nèi)栽培歷史最悠久、面積最廣泛的豆科牧草,堪稱“牧草之王”。紫花苜蓿具有產(chǎn)草量高、富含蛋白質(zhì)、生物固氮能力強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特性,對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展、糧食食品安全等具有重大作用。隨著人類活動(dòng)的增加,全球氣溫逐年上升,高溫?zé)岷ψ兊梅浅Ｍ怀?致使紫花苜蓿植株生長(zhǎng)緩慢、枯萎甚至死亡,病蟲害增多,嚴(yán)重抑制紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育,影響紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前在高溫對(duì)紫花苜蓿的研究主要集中在高溫對(duì)

2、紫花苜蓿的影響、紫花苜蓿適應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制及其耐熱性評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇和可靠性評(píng)價(jià)的方法等方面,而針對(duì)在分子水平尋找紫花苜蓿耐熱基因的研究還很少報(bào)導(dǎo)。
　　 抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybddization,SSH)是由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來的篩選未知差異基因的新技術(shù)。采用該技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得差異表達(dá)基因的cDNA片段,可有效富集稀有基

3、因序列1000倍以上,使某些低豐度表達(dá)的mRNA有望被檢出。為分離和獲得紫花苜蓿高溫脅迫誘導(dǎo)相關(guān)基因片段的EST序列。本試驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)秋眠級(jí)為6級(jí)的紫花苜蓿(ABI700)為材料,以45℃高溫脅迫下的紫花苜蓿幼嫩莖葉cDNA為tester,以正常生長(zhǎng)(22℃)的紫花苜蓿幼嫩莖葉cDNA為driver,利用SSH構(gòu)建了高溫脅迫下紫花苜蓿幼嫩莖葉的正向抑制消減文庫(kù)。從消減文庫(kù)中隨機(jī)挑取120個(gè)陽(yáng)性克隆,進(jìn)行菌液PCR鑒定。結(jié)果顯示,消減文庫(kù)的滴

4、度為4230pfu/ml,重組率為97.8％,插入片段大小主要集中在300-750bp之間。
　　 從消減cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取120個(gè)白斑,經(jīng)菌落PCR篩選得到117個(gè)差異表達(dá)的克隆。測(cè)序后得到111個(gè)質(zhì)量合格的EST序列,經(jīng)相同片段合并、電子克隆得到有效EST序列48個(gè)。根據(jù)在GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(nr)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTn序列比對(duì)結(jié)果,將這些EST分為3類:第一類代表已知基因共19個(gè)；第二類代表已知EST