高溫脅迫條件下紫花苜蓿抑制消減cDNA文庫的構建與初步分析.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是在世界范圍內栽培歷史最悠久、面積最廣泛的豆科牧草,堪稱“牧草之王”。紫花苜蓿具有產草量高、富含蛋白質、生物固氮能力強和適應性廣的特性,對我國畜牧業(yè)的發(fā)展、糧食食品安全等具有重大作用。隨著人類活動的增加,全球氣溫逐年上升,高溫熱害變得非常突出,致使紫花苜蓿植株生長緩慢、枯萎甚至死亡,病蟲害增多,嚴重抑制紫花苜蓿的生長發(fā)育,影響紫花苜蓿的產量和品質。目前在高溫對紫花苜蓿的研究主要集中在高溫對

2、紫花苜蓿的影響、紫花苜蓿適應高溫脅迫的機制及其耐熱性評價指標的選擇和可靠性評價的方法等方面,而針對在分子水平尋找紫花苜蓿耐熱基因的研究還很少報導。
　　 抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybddization,SSH)是由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術為基礎建立起來的篩選未知差異基因的新技術。采用該技術能夠在較短時間內獲得差異表達基因的cDNA片段,可有效富集稀有基

3、因序列1000倍以上,使某些低豐度表達的mRNA有望被檢出。為分離和獲得紫花苜蓿高溫脅迫誘導相關基因片段的EST序列。本試驗以標準秋眠級為6級的紫花苜蓿(ABI700)為材料,以45℃高溫脅迫下的紫花苜蓿幼嫩莖葉cDNA為tester,以正常生長(22℃)的紫花苜蓿幼嫩莖葉cDNA為driver,利用SSH構建了高溫脅迫下紫花苜蓿幼嫩莖葉的正向抑制消減文庫。從消減文庫中隨機挑取120個陽性克隆,進行菌液PCR鑒定。結果顯示,消減文庫的滴

4、度為4230pfu/ml,重組率為97.8％,插入片段大小主要集中在300-750bp之間。
　　 從消減cDNA文庫中隨機挑取120個白斑,經菌落PCR篩選得到117個差異表達的克隆。測序后得到111個質量合格的EST序列,經相同片段合并、電子克隆得到有效EST序列48個。根據(jù)在GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(nr)和EST數(shù)據(jù)庫中BLASTn序列比對結果,將這些EST分為3類:第一類代表已知基因共19個；第二類代表已知EST