hTERT沉默后消減文庫(kù)的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、目的：利用SSH技術(shù)篩選出hTERT基因的相關(guān)基因，從而尋找出與hTERT基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路，為深入研究hTERT基因的激活與調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。隨著hTERT轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制的逐漸明確，必將進(jìn)一步明確端粒酶在正常和腫瘤細(xì)胞中的激活機(jī)制，從而為靶向端粒酶的腫瘤治療和腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。 方法：利用SSH技術(shù)對(duì)hTERT沉默的hela細(xì)胞株進(jìn)行篩選，以未處理的hela細(xì)胞株cDNA為tester，以hTERT

2、沉默的hela細(xì)胞株cDNA為driver，進(jìn)行正向消減雜交；以hTERT沉默的hela細(xì)胞株cDNA為tester，以未處理的hela細(xì)胞株cDNA為driver，進(jìn)行反向消減雜交，得到hTERT沉默后的下調(diào)（或阻遏表達(dá)）和上調(diào)（或誘導(dǎo)表達(dá)）的兩個(gè)cDNA基因文庫(kù)。將文庫(kù)中的部分基因片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類。利用半定量RT—PCR以及實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證由SSH技術(shù)獲得的差異片段是否真正代表了hTERT相

3、關(guān)的基因。 結(jié)果：⑴利用SSH技術(shù)得到了hTERT沉默后的下調(diào)（或阻遏表達(dá)）或上調(diào)（或誘導(dǎo)表達(dá)）的兩個(gè)cDNA基因文庫(kù)。通過(guò)消減效率分析表明，兩個(gè)文庫(kù)中的管家基因GAPDH均被消減了近1024倍。因此，SSH技術(shù)可用來(lái)尋找hTERT沉默后的相關(guān)基因。⑵對(duì)兩個(gè)基因文庫(kù)中的部分基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步建立了hTERT相關(guān)基因功能表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)hTERT相關(guān)基因功能涉及新陳代謝、能量、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、蛋白質(zhì)活性調(diào)控、細(xì)胞通信及信號(hào)轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)、細(xì)胞防御與毒性、環(huán)境相互作用、細(xì)胞命運(yùn)、器官分化等方面。⑶對(duì)部分差異基因進(jìn)行半定量RT—PCR以及實(shí)時(shí)定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)在hela細(xì)胞和hTERT沉默后的hela細(xì)胞中這些基因的表達(dá)量確有差異。因此，消減雜交成功，可進(jìn)一步作為hTERT的相關(guān)基因進(jìn)行研究。 結(jié)論：①SSH技術(shù)可用來(lái)尋找hTERT沉默后的相關(guān)基因。②利用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了兩個(gè)cDNA基因文庫(kù)，可進(jìn)一步作為hTERT的相關(guān)基因進(jìn)行深入研究。③兩個(gè)cDNA基因