慢性腎炎腎陰虛證cDNA消減文庫的構(gòu)建.pdf

1、[背景] “證”是中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)，也是中醫(yī)的精華所在，對中醫(yī)研究的逐步深入，勢必要觸及“證”本質(zhì)的研究。中醫(yī)“證”是疾病發(fā)生過程中不同階段病因病機的高度概括，同一證有共同的臨床表現(xiàn)和病理機制，那么證一定有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。幾十年有關(guān)證的本質(zhì)的研究中，初步證實“證”具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)。按照分子生物學(xué)與生命的中心法則，基因型(DNA或基因)處于最原始和最本質(zhì)的地位，主宰和制約表現(xiàn)型(蛋白質(zhì)→細胞→有機體)程序的發(fā)生發(fā)展。生命現(xiàn)象、

2、疾病、中醫(yī)證候都可以從DNA或基因水平的研究獲得最本質(zhì)的答案。腎藏精，為先天之本，主生長、發(fā)育、生殖及水液代謝等。中醫(yī)認為腎所藏之精源于父精母血的生殖之精，與生俱來，是構(gòu)成胚胎發(fā)育的原始物質(zhì)。腎精這一原始物質(zhì)即先天之精，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)描述的遺傳物質(zhì)(即基因組)具有一定的同一性。因此我們認為腎虛證表型的諸多病理生理學(xué)改變之間的聯(lián)系完全可以從基因水平找到答案。慢性腎炎是我國多發(fā)病常見病，在人群發(fā)病率5％，每年有10萬計病人發(fā)展成為慢性腎衰，是嚴

3、重危害人民健康的疾病。于是，我們認為從慢性腎炎這一病種入手，辨病與辨證相結(jié)合進行腎虛證相關(guān)基因的研究，是一個非常合適的切入點。 [目的] 構(gòu)建慢性腎炎腎陰虛證的cDNA消減文庫。 [方法] 1.用TRIzol抽提總RNA，用SMART(switchingmechanismat5'-endofRNAtranscript)技術(shù)擴增微量RNA，用Chromaspin-1000純化擴增的cDNA，用RsaⅠ或Ha

4、eⅢ酶切cDNA。 2.抑制性消減雜交方法(suppressionsubtractivehybridization，SSH)的建立取正常組擴增的4μgcDNA將其分為兩份，其中一份2μgcDNA作為驅(qū)動方(Driver)，而另一份2μgcDNA加入0.2ng質(zhì)粒(ψ)X174作為實驗方(Tester)。用應(yīng)用HaeⅢ酶切制備驅(qū)動子、檢測子，此經(jīng)HaeⅢ酶切的質(zhì)粒(ψ)X174DNA片段作為所要篩選的差異基因，連接不同接頭，經(jīng)過兩

5、次消減雜交，兩次PCR擴增，建立SSH方法。并依據(jù)目標(biāo)cDNA與背景cDNA(假陽性產(chǎn)物)間的以下差異為基礎(chǔ)：各種背景克隆分子只單向?qū)?yīng)于SSH中兩種不同側(cè)翼接頭序列中的一種，而目標(biāo)cDNA片斷同時具有兩種側(cè)翼接頭序列，在SSH基礎(chǔ)上進行鏡像選擇(mirrororientationselection，MOS)，以去除常規(guī)SSH方法的背景分子，提高消減文庫的質(zhì)量。 3.應(yīng)用上述建立的SSH方法構(gòu)建慢性腎炎腎陰虛證的cDNA消減文庫

6、，消減文庫經(jīng)PCR擴增后，采用T/A克隆，應(yīng)用藍白斑系統(tǒng)篩選出陽性克隆(白色)，再經(jīng)點雜交篩選陽性克隆，進行測序，測序結(jié)果采用BLAST進行同源性分析。 [結(jié)果] 1.用TRIzol抽提的總RNA純度高(1.80＜OD260nm/OD280nm＜2.00)，用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示樣品RNA有清晰的28S和18S條帶，其比值約為2∶1，提示樣品RNA沒有明顯的降解，可直接進行下面實驗。應(yīng)用SMART技術(shù)擴增微量RNA，擴

7、增產(chǎn)物雙鏈cDNA主要分布在0.5～10kb，呈長瀑布條帶，說明cDNA合成較好。用Chromaspin-1000純化柱純化后，明顯提高了擴增產(chǎn)物中的全長基因比例。 2.本實驗獲得的消減雜交產(chǎn)物，經(jīng)PCR擴增后，獲得與質(zhì)粒(ψ)X174DNA被HaeⅢ酶切后相似條帶，僅分子量略大一些，這是由于PCR擴增的目的產(chǎn)物兩側(cè)帶有部分接頭，提示建立的SSH方法是成功的。而且經(jīng)過MOS后，能夠明顯降低背景，提示MOS對于進一步去除假陽性產(chǎn)物

8、是非常必要的。 3.本研究成功地構(gòu)建了慢性腎炎腎陰虛證cDNA消減文庫，消減產(chǎn)物進行PCR擴增、T/A克隆，應(yīng)用藍白斑系統(tǒng)篩選，正向消減文庫共獲得200個陽性克隆(白色)，反向消減文庫獲得184個陽性克隆(白色)，經(jīng)PCR初步鑒定陽性克隆率高，分別隨機挑取48個克隆，應(yīng)用點雜交進一步篩選差異表達基因，正向消減文庫中初步篩選出5個克隆可能為差異表達基因，反向消減文庫中初步篩選出5個克隆可能為差異表達基因。 4.從正向消減文

9、庫中隨機挑選5個克隆，測序后經(jīng)BLAST同源性分析，結(jié)果顯示：4個表達序列標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)為已知基因，1個EST是golgiSNAPreceptorcomplexmember2，1個EST是nucleolarprotein5A，1個EST是down-regulatorofHLAⅡ，1個EST是UREB1，1個EST為未找到同源性序列，提示其可能為新基因。 5.從反向消減文庫中隨機挑選5個克

10、隆，測序后經(jīng)BLAST同源性分析，結(jié)果顯示1個測序不成功，1個EST為已知基因mitochondrialGTP-bindingprotein1，1個EST是hypotheticalproteinLOC253842，1個EST在染色體上能找到同源性序列，但未發(fā)現(xiàn)同源性基因，1個EST為未找到同源性序列，提示后面3個EST可能為新基因。 [結(jié)論] 1.本研究成功地運用SMART技術(shù)擴增微量RNA，建立并完善了SSH方法。