天冬酰胺合成酶在肝細胞癌中的表達與預后分析及功能研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 肝細胞癌(HCC)是世界范圍內最常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第五位，死亡率位于第三位。HCC也是我國常見高發(fā)腫瘤之一，每年新增患者占全世界新增患者的一半，且發(fā)病率逐年上升。HCC高復發(fā)、高轉移、對化療敏感性低、預后差，是全球最常見的致死性惡性腫瘤之一。HCC同乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒以及黃曲霉毒素污染等因素相關，其發(fā)生與發(fā)展是由體內多種基因參與的，多種步驟協(xié)

2、同作用的一個復雜過程。
　　 手術切除、肝臟移植、局部消融以及經皮肝動脈化療栓塞術(TACE)是目前HCC的常用治療方法，其中，外科根治性切除是目前HCC首選治療方法之一，但術后極易復發(fā)，并成為死亡的主要原因。手術切除及肝移植是目前治療HCC最為有效的方法，但是HCC患者在患病早期癥狀并不明顯，并且缺少特異性高的腫瘤標志物以及供肝缺乏等原因，只有少數(shù)病人能夠獲得手術切除或者肝移植的機會，加之HCC具有高度惡性的生物學行為，手術后

3、容易出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)以及轉移，從而影響患者生存率，在全世界范圍內，HCC的5年生存率僅有3％-5％，HCC術后5年生存率也僅有30％-40％。此外，對化療藥物的不敏感，也是HCC患者生存率低的一個原因。目前臨床上常用的TNM分期和BCLC分期，是HCC預后的重要參考指標，但傳統(tǒng)的臨床分期來預測肝癌的預后是有缺陷的，HCC的預后，與其自身分子生物學行為密切相關。此外，傳統(tǒng)的HCC病理學診斷、分型以及分類方法也存在局限性，無法從分子水平上體現(xiàn)

4、肝癌的生物學行為，無法充分反映HCC的真實本質，更無法準確預測HCC的分子生物學行為。因此，尋找能夠反映HCC分子生物學特征的標志，并對其功能進行研究，是目前肝癌研究的重要方向。
　　 天冬酰胺合成酶(ASNS)主要定位于胞漿中，依賴ATP催化天冬氨酸與谷氨酰胺生成天冬酰胺與谷氨酸。ASNS在倉鼠的ts11細胞中發(fā)揮促進細胞通過G1期從而完成細胞周期的作用;ASNS過表達可以減輕胰腺癌細胞因為葡萄糖剝奪或者順鉑誘導的腫瘤細胞的凋

5、亡，提示其在胰腺癌細胞中可能起到抗凋亡的作用;ASNS在急性淋巴細胞白血病以及部分急性髓性細胞白血病對天冬酰胺酶治療耐藥的病人中的表達升高，故ASNS的表達強弱被認為同天冬酰胺酶是否耐藥相關;ASNS也可以作為在卵巢癌及胰腺癌的細胞系中天冬酰胺酶治療敏感性的生物學標志，ASNS低表達的腫瘤細胞對天冬酰胺酶更敏感;此外，還有研究認為ASNS在去勢手術耐受的前列腺癌（CRPC）中高表達，利用ASNS抑制劑來耗竭天冬酰胺可能是治療CRPC病人

6、的一個新的方法策略。
　　 我們前期通過蛋白組學技術篩選出ASNS在肝細胞癌腫瘤組織中特異性高表達，提示ASNS可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。目前對ASNS在肝細胞癌中的表達情況、預后分析以及功能研究尚無文獻報道。因此，本研究的目的一方面研究ASNS在肝癌中的表達情況并結合臨床資料探討其表達與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系;另一方面研究ASNS在肝癌中的生物學作用及機制;為深入了解肝細胞癌的生物學行為以及為可能的靶向治療提供理論依據。

7、
　　 實驗方法:
　　 1.運用real-time PCR、western blot以及IHC等方法檢測肝細胞癌、癌旁及正常肝組織中ASNS的表達情況;
　　 2.IHC方法檢測大鼠DEN誘癌過程中ASNS在肝臟中表達的動態(tài)變化過程;
　　 3.結合臨床資料統(tǒng)計分析ASNS與相關臨床指標及預后之間的關系;
　　 4.資料收集及統(tǒng)計方法:
　　 (1)隨機選取2002-2007年在我院行肝

8、癌根治術的原發(fā)性肝細胞癌患者標本269例，制作組織芯片，并收集完善病史及隨訪資料;以免疫組化方法檢測組織芯片標本中ASNS的表達，并統(tǒng)計分析ASNS的表達與肝癌患者各項臨床特征（腫瘤大小、血管侵犯、肝內播散和遠處轉移等）及遠期生存（無瘤生存率、總生存率和生存時間等）的關系。
　　 (2)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果以median(Q1-Q3)表示。x2檢驗或Fisher確切概率法用來進行定性資料的比較。組間定量分析用

9、wilcoxon配對秩檢驗。相關性分析采用spearman秩相關。累計生存和復發(fā)率的計算采用Kaplan-Meier，生存曲線用Log-rank繪制并進行生存分析。P＜0.05視為統(tǒng)計顯著。
　　 5.構建ASNS過表達及RNA干擾質粒并轉染肝癌細胞系，western blot鑒定效果;構建ASNS RNA干擾慢病毒并感染肝癌細胞系，獲得ASNS穩(wěn)定敲減的MHCC97H及MHCCLM3細胞株。
　　 6.CCK-8方法檢

10、測ASNS高低表達對多種肝癌細胞系增殖的影響;
　　 7.平板克隆形式實驗檢測ASNS高低表達細胞株的克隆形成能力;
　　 8.Transwell方法檢測ASNS高低表達細胞株的遷移及侵襲能力;
　　 9.spheroid克隆形成實驗檢測ASNS高低表達對細胞株的干細胞自我更新能力的影響;
　　 10.用western blot檢測在TNFα與CHX刺激下ASNS高低表達對細胞凋亡的影響;
　　

11、11.擴增ASNS高低表達穩(wěn)轉細胞系行裸鼠皮下荷瘤，觀察腫瘤生長情況;
　　 12.ASNS高低表達穩(wěn)轉細胞株行裸鼠尾靜脈注射，觀察肺轉移情況及裸鼠生存情況;
　　 13.CCK-8方法檢測ASNS高低表達細胞株在天冬酰胺酶處理后的增殖能力;
　　 14.裸鼠皮下荷瘤后腹腔內注射天冬酰胺酶，觀察ASNS高低表達細胞株腫瘤生長情況;
　　 15.觀察高低表達ASNS肝癌細胞對抗外界刺激能力(H2O2)的影響

12、;
　　 實驗結果:
　　 1.ASNS在肝癌組織中高表達:
　　 (1) ASNS在58例原發(fā)性肝細胞癌組織中的mRNA表達水平顯著高于及癌旁組織樣本中，兩者差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.0008)。與18例正常肝組織相比，58對原發(fā)性肝細胞癌及癌旁組織樣本中ASNS的mRNA表達水平顯著增高，差別均有統(tǒng)計學意義(P=0.0036，P=0.0258)。58對原發(fā)性肝癌與癌旁組織中，ASNS的mRNA表達水平，癌組

13、織中高于癌旁組織的有44對(44/58，76％)。
　　 (2) ASNS在10對肝癌及其癌旁組織樣本中的蛋白表達，7對(70％)在癌組織中表達高于癌旁組織。
　　 (3)在269例肝癌病人組織芯片標本中，ASNS在肝癌組織中蛋白水平的表達高于癌旁組織及正常肝臟組織，差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.01);
　　 2.在大鼠DEN誘癌過程中，ASNS在肝臟中的表達逐漸升高:
　　 IHC顯示隨著

14、DEN誘癌時間延長，ASNS表達逐漸升高，在晚期肝硬化期及早期肝癌期ASNS的表達水平達到最高，隨著時間的延長與腫瘤的進展，ASNS的表達水平下降，而對照組大鼠肝臟ASNS的表達無明顯變化，始終低于DEN組。
　　 3.臨床資料統(tǒng)計分析:
　　 (1)卡方檢驗顯示ASNS在肝細胞癌中的表達水平與血清AFP水平、腫瘤直徑、鏡下血管侵犯、腫瘤包膜完整性、BCLC分期及TNM分期負相關，與術前白蛋白水平正相關;
　　

15、(2) ASNS表達與1，3，5年生存時間呈正相關并具有統(tǒng)計學意義，ASNS是影響肝癌患者術后總體生存率的獨立預后保護因素(Hazard ration0.744，95％CI0.565-0.979)。
　　 4.構建了ASNS過表達及RNA干擾質粒，構建了ASNS的RNA干擾慢病毒并分別構建和鑒定了MHCCLM3及MHCC97H高低表達的穩(wěn)定細胞系;
　　 5.ASNS的差異表達對肝癌生物學功能的影響:
　　 (1

16、)瞬時轉染過表達ASNS抑制肝癌細胞增殖，ASNS敲減促進肝癌細胞增殖;
　　 (2) ASNS敲減增強肝癌細胞克隆隆形成能力;
　　 (3) ASNS過表達下調CyclinD1表達并引起細胞周期阻滯于G1期;ASNS敲減促進細胞周期的進展并上調CyclinD1表達;
　　 (4)ASNS敲減促進皮下荷瘤裸鼠的腫瘤增殖能力;
　　 (5)ASNS敲減增強肝癌細胞遷移能力及侵襲能力(P＜0.01)，過表達A

17、SNS抑制肝癌細胞的遷移能力(P＜0.01);
　　 (6)ASNS敲減增強尾靜脈注射裸鼠的肝癌細胞的肺轉移能力(P＜0.01)，增加其死亡率(P＜0.05);
　　 (7)ASNS敲減抑制肝癌細胞的凋亡;
　　 (8)ASNS敲減可減輕肝癌細胞中的氧化應激;
　　 (9)ASNS敲減可增強肝癌細胞的自我更新能力(P＜0.01)。
　　 6.ASNS敲減增強肝癌細胞對天冬酰胺酶的敏感性:
　

18、　 (1)天冬酰胺酶對ASNS低表達的SMMC7721與PLC細胞株增殖的抑制明顯強于ASNS高表達的MHCCLM3與MHCC97H細胞株;在天冬酰胺酶處理下，ASNS敲減的肝癌細胞增殖能力顯著低于對照細胞株(P＜0.01);
　　 (2)皮下注射ASNS敲減肝癌細胞的裸鼠經腹腔注射天冬酰胺酶，其腫瘤體積較皮下注射對照細胞組裸鼠顯著減小(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 本研究發(fā)現(xiàn)ASNS在肝癌組織中高表達

19、，與血清AFP水平、術前白蛋白水平、腫瘤直徑、鏡下血管侵犯、腫瘤包膜完整性、BCLC分期及TNM分期密切相關。ASNS是肝癌患者術后生存的獨立預后因素，有望成為肝癌預后評估的一項有前景的指標。進一步體內和體外實驗研究表明ASNS在肝癌發(fā)生過程中起抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及自我更新，促進凋亡與增強氧化應激的作用，其抑制增殖可能通過抑制細胞周期素CyclinD1的表達而發(fā)揮其生物學作用。另外，ASNS的表達與天冬酰胺酶處理的敏感性有關，