對(duì)白血病化療藥物左旋天冬酰胺酶Ⅱ的熱穩(wěn)定性改造以及微小殘留白血病DNA疫苗的構(gòu)建、純化和免疫效果研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文對(duì)白血病化療藥物左旋天冬酰胺酶Ⅱ的熱穩(wěn)定性改造以及微小殘留白血病DNA疫苗的構(gòu)建、純化和免疫效果研究姓名：李亮助申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：孫茂盛;邵一鳴20080401北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所博一l ：研究生學(xué)位論文摘 要在治療急性淋巴細(xì)胞白血病的臨床實(shí)踐中有兩個(gè)長期困擾人們的難題：一個(gè)是化療藥物的副作用問題；另一個(gè)是導(dǎo)致白血病完全緩解后又不斷復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞微小殘留問題。本課

2、題針對(duì)這兩個(gè)問題進(jìn)行了初步的探索。在急性淋巴細(xì)胞白血病的化療方案中，左旋大腸桿菌天冬酰胺酶I I 是重要的藥物組成部分。但是該酶具有較大的副作用，同時(shí)由于其相對(duì)較短的半衰期和熱不穩(wěn)定性，使得該藥在實(shí)際治療中需要進(jìn)行頻繁地注射，結(jié)果使病人產(chǎn)生了更大的痛苦。因此在本研究課題中對(duì)如何提高該酶的熱穩(wěn)定性以便進(jìn)一步提高其半衰期進(jìn)行了初步研究：通過生物信息學(xué)分析手段確定了天冬酰胺酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中一個(gè)與熱穩(wěn)定性關(guān)系密切的B ．轉(zhuǎn)角，并用定點(diǎn)突變的方

3、法將該轉(zhuǎn)角上的第1 7 8 位的天冬氨酸突變?yōu)楦彼帷?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與野生型酶相比，突變體酶在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性得到了提高；從能量角度上看，改造后的酶在保持動(dòng)力學(xué)性質(zhì)( K m 和‰) 基本不變的同時(shí)活化能得到了增加。這說明筆者對(duì)左旋天冬酰胺酶的改造在不影響酶活性的前提下提高了其熱穩(wěn)定性。對(duì)于化療和骨髓移植不能徹底解決的白血病細(xì)胞微小殘留問題，本課題對(duì)相應(yīng)的免疫學(xué)解決方案進(jìn)行了探索。雖然腫瘤細(xì)胞疫苗在目前來說是一種較有前景的免疫治

4、療形式，但出于對(duì)其安全性方面考慮，筆者決定嘗試用另外一種相對(duì)安全的免疫形式——D N A 疫苗，來治療微小殘留白血病，并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了初步研究。本課題采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)經(jīng)過改造滅活的腫瘤細(xì)胞特異性超表達(dá)抗原生存素( s u r v i v i n ) 和能特異性引起T h l 細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)夾狀單鏈R N A ( s s R N A ) ：另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)細(xì)胞因子G M ．C S F 和共刺激分子C D 8 0 。結(jié)果

5、證明用該D N A 疫苗系統(tǒng)免疫B a l B ／C 小鼠能引起較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)較強(qiáng)的T 細(xì)胞增殖和對(duì)腫瘤細(xì)胞的C T L 殺傷活力。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究D N A 疫苗對(duì)微小殘留白血病的實(shí)際治療提供了前期實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。D N A 疫苗大規(guī)模純化技術(shù)的研發(fā)是D N A 疫苗走向?qū)嶋H臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)的必不可少的環(huán)節(jié)。本課題重點(diǎn)對(duì)利用排阻層析純化質(zhì)粒的技術(shù)進(jìn)行了研究。筆者對(duì)不同種類及不同濃度鹽緩沖液存在時(shí)，各種核酸分子排阻層析