白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的分子進(jìn)化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、纖維素是地球上含量最豐富的可再生物質(zhì)，纖維素酶能夠?qū)⑵渌鉃槠咸烟牵瑸槭称泛湍茉刺峁┰?，然而目前的纖維素酶活力低、熱穩(wěn)定性差、成本高，其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用受到嚴(yán)重制約，因此有必要對(duì)已有的纖維素酶進(jìn)行改造，使其性能有所改善。本研究同時(shí)采用隨機(jī)突變和定點(diǎn)飽和突變的方法對(duì)臺(tái)灣家白蟻內(nèi)切葡聚糖酶CfEG進(jìn)行了分子進(jìn)化。
　　 運(yùn)用易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變庫(kù)，篩選到兩株突變子K28E和F241L。K28E的最適pH比原始酶提高了0.5個(gè)單位，F(xiàn)2

2、41L的Tm值下降了近4℃。
　　 采用半理性設(shè)計(jì)方法，在網(wǎng)站SWISS-MODEL以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中高山象白蟻內(nèi)切纖維素酶NtEG（PDB id=1Ks8）的三維結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)CfEG進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模（二者氨基酸的同源性為79％）。比較同源建模預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)和模板NtEG的三維結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件ProSa2003，根據(jù)能量變化確定了CfEG活性中心內(nèi)的六個(gè)飽和突變位點(diǎn)D53、D56、E411、D122、R

3、360及Y407，其中D53、D56、E411分別與NtEG的催化殘基D54、D57、E412重合。對(duì)位點(diǎn)K28、F241也做了飽和突變以進(jìn)一步篩選突變子，此外，根據(jù)多序列比對(duì)做了定點(diǎn)突變H305Y。
　　 定點(diǎn)（飽和）突變庫(kù)共得到18個(gè)突變子。突變子D53E、D56C的羧甲基纖維素酶活提高了20％，疊加突變D53C/D56C、D53E/D56C則喪失了活力，雙突變子D53L/D56I、D53E/D56S的比活比原始酶分別提高了

4、近2倍和1.45倍。E411飽和突變子庫(kù)均沒有活性，進(jìn)一步將其替換為近似氨基酸的E411D、E411Q定點(diǎn)突變子也喪失了酶活。由突變結(jié)果可推斷，位點(diǎn)E411為該酶行使功能的必需殘基。D122、K28、F241位點(diǎn)的突變子均酶活降低或失活，R360及Y407位點(diǎn)突變子的比活和野生酶相差不大。與野生酶相比，突變子D53E、D122C、D122E的酶活最適溫度下降了5℃；突變酶D56C的最適pH提高了1.5個(gè)單位，D53L/D56I、D122

5、C、R360K和K28E的最適pH提高了0.5個(gè)單位，Y407V和K28H的最適pH下降了0.5個(gè)單位；突變酶D53C、D56C的Tm值升高了4℃，D122C、D122E的Tm提高了約2℃，而Y407V、F241L的Tm值降低了近4℃。
　　 本研究通過蛋白質(zhì)分子進(jìn)化探索獲得新酶的有效途徑，通過分析比較獲得的突變酶的性質(zhì)變化，積累對(duì)工業(yè)用酶分子改造的經(jīng)驗(yàn)，此外，對(duì)研究臺(tái)灣家白蟻內(nèi)切葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系也具有非常重要的意義。