β-1,3-1,4-葡聚糖酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)作為一種重要的工業(yè)用酶，在作為飼料添加劑改善谷類營養(yǎng)價值和改善啤酒風(fēng)味方面發(fā)揮著重要的作用。本文對重組大腸桿菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)菌株發(fā)酵生產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝條件進行了系統(tǒng)的優(yōu)化研究，并詳細(xì)分析了粗酶提取液的酶學(xué)性質(zhì)。
　　 首先選用了6種常用的培養(yǎng)基，選擇出最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為TB-GN培養(yǎng)基，采用單因素

2、試驗研究了培養(yǎng)基碳源、氮源及碳氮比對重組大腸桿菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)分泌表達β-1，3-1，4-葡聚糖酶的影響。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計法和響應(yīng)面分析法對以上影響因素進行優(yōu)化，得出最優(yōu)培養(yǎng)基成分為(g/L)：甘油10.01，酪蛋白胨12.03，酵母粉24，NaCl10，(NH4)2SO44.77，KH2PO42.31，K2HPO412.54。利用優(yōu)化培養(yǎng)基下在37℃、150r

3、pm條件下，搖瓶培養(yǎng)27h，胞外酶活達到78.32U/mL，是初始培養(yǎng)基酶活的3.10倍。
　　 采用單因子實驗法對搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化進行了研究，研究了溫度、初始pH、種齡、接種量以及誘導(dǎo)劑IPTG和表面活性劑吐溫80對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響，確定最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度41℃，初始pH7.0，接種量1.5％，種齡16h。IPTG誘導(dǎo)對重組大腸桿菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)表達β-1，3-1

4、，4-葡聚糖酶無促進作用，而表面活性添加劑吐溫80對重組大腸桿菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl-(kil-Km)產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有顯著促進作用，最佳添加濃度為2.5%。
　　 搖瓶流加證明穩(wěn)定期流加碳源和有機無機氮源（硫酸銨和酪蛋白胨混合物）是非常有效的。采用2.5L發(fā)酵罐對重組大腸桿菌Rosetta(DE3)-pET-22-bgl(kil-Km)產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶進行放大培養(yǎng)，酶活和

5、生物量增長明顯，胞外酶活在48h達到最大，為140U/mL。結(jié)合搖瓶流加和培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果進行了2.5L發(fā)酵罐流加工藝研究，結(jié)果表明，在穩(wěn)定期恒速流加碳源甘油，對細(xì)胞生長和產(chǎn)酶都有極大的促進作用。最大胞外酶活高達327.7U/mL，為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的4.18倍，是間歇發(fā)酵的2.34倍。
　　 對β-1，3-1，4-葡聚糖酶粗酶液性質(zhì)的實驗表明，β-1，3-1，4-葡聚糖酶專一性作用于含β-1，3-和β-1，4-混合鍵型的β-葡聚糖

6、。β-1，3-1，4-葡聚糖酶粗酶液最適反應(yīng)時間為10min，最適反應(yīng)溫度為50℃，30～60℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定。最適反應(yīng)pH為6.0，pH在5～12的范圍內(nèi)較穩(wěn)定，而且耐堿性相對較強。金屬離子中，Cu2+、Fe3+、與Zn+在10mM濃度下對β-1，3-1，4-葡聚糖酶有抑制作用，Mg2+、Na+、Co2+、Ca2+，K+離子對β-1，3-1，4-葡聚糖酶均有促進作用。NH4+、Mn+促進作用較弱。比較發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌Rosetta(DE