青稞β-1，3-葡聚糖酶的純化、性質(zhì)及抗體制備.pdf

1、β-1,3-葡聚糖酶[EC 3.2.1.39]存在于大多數(shù)高等植物中。按植物種類(lèi)、生理發(fā)育期或細(xì)胞定位的不同，認(rèn)為存在一個(gè)同功酶家族，可按分子量、等電點(diǎn)、蛋白－級(jí)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位、作用方式分為多種類(lèi)型。β-1，3-葡聚糖酶在細(xì)胞分裂，小孢子發(fā)生，胚發(fā)生等生理發(fā)育活動(dòng)中起作用，且很有可能參與植物抵抗真菌的防御反應(yīng)，是一類(lèi)重要的與病程相關(guān)的蛋白(PR-2)。青稞是我國(guó)青海、西藏地區(qū)特有的高原耐寒作物，有報(bào)道認(rèn)為青稞種子中含有較高的β-1，3-

2、葡聚糖酶。 本實(shí)驗(yàn)將萌發(fā)的青稞種子經(jīng)醋酸鈉緩沖液抽提，50％～85％硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Cellulose 52，CM-Sephamse(Fast Flow)離子交換層析和SephadexG-75分子篩層析，得到具活性的β-1,3-葡聚糖酶。SDS-PAGE檢測(cè)顯示分子量27 kDa左右的主帶(95％)。以海帶多糖為底物做酶學(xué)性質(zhì)研究表明：純化的β-1,3-葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度35℃，最適反應(yīng)pH值范圍5.0～5.5之間，

3、Km為0.59mg/mL。β-1,3-葡聚糖酶是一種熱敏感蛋白，隨溫度升高，酶活力下降。外加Ca<'2+>對(duì)酶有激活作用，激活作用不明顯，這與Manners D.J等報(bào)道的一致；Pg<'2+>對(duì)酶有抑制作用，且抑制效果明顯。蛋白熒光光譜分析也表明金屬離子可能與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)作用，使酶分子中的Trp和Tyr殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變。 本文還將純化的β-1,3-葡聚糖酶對(duì)新西蘭兔進(jìn)行免疫制備抗血清，雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定效價(jià)為1:64。免

4、疫印跡分析表明：制備的兔抗青稞β-1,3-葡聚糖酶抗血清能對(duì)青稞和小麥種子粗酶液中的27 kDa β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行特異性檢測(cè)；另外，分別在青稞粗酶液67 kDa處檢測(cè)到1條微弱雜交帶，小麥35 kDa，67 kDa處檢測(cè)到2條雜交帶，推測(cè)可能是粗酶液中存在相應(yīng)分子量的與此β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列相似的同功酶，從而導(dǎo)致免疫交叉反應(yīng)。對(duì)萌發(fā)不同時(shí)期的青稞、小麥種子β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定顯示粗酶液活性均呈上升趨勢(shì)，且青稞粗