構巢曲霉β-1，3-葡聚糖酶ENGA的異源重組表達、鑒定及生理功能研究.pdf

1、真菌細胞壁是位于真菌原生質體外的一種剛性結構，在真菌的生理活動中起到重要的作用。真菌細胞壁中含有大量的葡聚糖和幾丁質，構成細胞壁的骨架。在真菌部分生理活動中，如絲狀真菌菌絲分支或酵母的出芽和分裂過程中，內切β-1，3-葡聚糖酶可能通過水解作用維持細胞壁的可塑性。此外，真菌內切β-1，3-葡聚糖酶還參與胞外營養(yǎng)物質的利用及細胞壁的自溶過程。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，灰蓋鬼傘的葡聚糖內切酶ENG1參與細胞壁的重構，本研究以子囊屬真菌

2、構巢曲霉為研究材料，在數(shù)據(jù)庫中查到構巢曲霉GH16家族共有10個基因。本研究希望利用重組表達研究上述葡聚糖內切酶的酶學性質，最終成功的重組表達一個具有水解活性的β-1，3-葡聚糖酶蛋白(AN0245)，并對它的酶學性質及生理功能展開了研究。
　　本研究以甲醇誘導型的畢赤酵母為宿主細胞，對構巢曲霉GH16中的內切-β-1，3(4)-葡聚糖酶ENGA進行異源重組表達。重組表達菌株在30℃培養(yǎng)條件下以每24 h添加終濃度為0.5％的甲醇

3、進行誘導表達，可在胞外表達出有活性的蛋白，將粗酶液用Ni-柱純化后獲得大量含高活性的ENGA蛋白，SDS-PAGE顯示ENGA的分子量大小為37 KDa。對該酶的酶學性質研究發(fā)現(xiàn)，其最適反應溫度為60℃和最適pH為pH5.5，具有較寬的溫度穩(wěn)定性(20-70℃)和pH穩(wěn)定性(4.0-9.0)，HPAEC分析顯示ENGA具有β-1，3-葡聚糖內切水解酶活性和轉糖基活性，在以昆布多糖為底物時，動力學參數(shù)Km和Vmax分別為30 mg/mL，