芽孢桿菌M1降解苯并芘的條件優(yōu)化及其機理研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的持久性有機污染物，具有致畸、致癌、致突變效應(yīng)，對生態(tài)環(huán)境和人體健康具有很大危害。其中苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)屬于高環(huán)PAHs(HMW-PAHs)，是多環(huán)芳烴中毒性最大的一種強烈致癌物，是進行科學研究的標志性污染物。芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)是環(huán)境中一類常見的細菌，在其降解多環(huán)芳烴的功能方面

2、有相關(guān)報道，在降解中扮演著重要角色。在細菌降解BaP的過程中，中間代謝產(chǎn)物變化快、累積少且分離難度大。只有少數(shù)研究分離到了BaP代謝的中間產(chǎn)物，但這些代謝物并不全面，目前尚無法形成完整的Bacillus代謝BaP途徑鏈，需要深入挖掘新的代謝產(chǎn)物。本課題組前期分離到一株高效降解苯并[a]芘的芽孢桿菌Bacillus sp.M1，其在含苯并[a]芘(PAHs總量10μg/mL)的無機鹽溶液中的降解率達54.11％，但對該菌株的優(yōu)化降解條件及

3、代謝產(chǎn)物、酶活性及基因表達機理尚不清晰。因此，本文以Bacillus sp.M1為研究對象，在優(yōu)化其生長和降解BaP條件的基礎(chǔ)上，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)探討M1代謝BaP產(chǎn)生的中間產(chǎn)物及酶活性，進一步利用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析相關(guān)降解基因，揭示M1代謝BaP機理。其主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過單因素和多因素試驗，優(yōu)化了菌株Bacillus sp.M1的生長條件以及BaP降解的條件。結(jié)果表明，M1的適宜生長條件為溫度30

4、℃，pH7.0～8.0;BaP降解率達最優(yōu)(90.13％)的條件為BaP初始濃度5μg/mL、接菌量5％、溫度30℃、pH7.0、含鹽量1％、營養(yǎng)調(diào)理劑L含量1.5g/L。
　　(2)通過以PAHs中間代謝產(chǎn)物為唯一碳源的M1生長試驗和M1降解BaP的代謝產(chǎn)物試驗，研究推導(dǎo)了Bacillus sp.M1代謝BaP的基本途徑。結(jié)果顯示，在鄰苯二甲酸、原兒茶酸、水楊酸、鄰苯二酚、龍膽酸作為唯一碳源的條件下，Bacillus sp.M1

5、2天內(nèi)對底物利用率分別達91.88％、86.02％、87.07％、65.50％、92.28％，說明了該菌株能夠代謝這些小分量苯環(huán)有機物，M1可能通過水楊酸和鄰苯二甲酸兩種途徑代謝BaP。為進一步證實其代謝途徑，檢測了M1降解BaP過程中的中間產(chǎn)物，其中4，5-二甲基菲，鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，硅烷基化的鄰苯二酚、水楊酸等17種中間產(chǎn)物被檢測到，鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)累積突出。推測菌株M1的BaP降解初始位置發(fā)生在C-9和C-10位置或者C-7和

6、C-8位置，在酶作用下生成Pyr，隨后Pyr開環(huán)生成4，5-二甲基菲，在相關(guān)酶作用下生成1-羥基-2-萘甲酸，同時存在鄰苯二甲酸和水楊酸兩條平行的下游代謝途徑，并以鄰苯二甲酸代謝途徑為主。
　　(3)通過測定BaP誘導(dǎo)下菌體M1酶活性試驗，明確M1酶活性與其BaP降解率的關(guān)系。結(jié)果表明，鄰苯二甲酸雙加氧酶、水楊酸羥化酶、鄰苯二酚-1，2-雙加氧酶、鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶、龍膽酸雙加氧酶、脫氫酶6種酶的酶活性與BaP的降解率呈顯

7、著正相關(guān)，是M1代謝BaP的關(guān)鍵酶。說明M1代謝BaP過程中同時存在水楊酸和鄰苯二甲酸途徑，水楊酸再經(jīng)水楊酸羥化酶被代謝為鄰苯二酚和龍膽酸，鄰苯二酚和龍膽酸在鄰苯二酚-1，2-雙加氧酶、鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶、龍膽酸雙加氧酶的作用下最終進入三羧酸循環(huán)階段，生成CO2和H2O;鄰苯二甲酸在鄰苯二甲酸雙加氧酶作用下被降解為原兒茶酸，產(chǎn)物最終進入三羧酸循環(huán)階段，生成CO2和H2O。
　　(4)利用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序，對菌株Bacil

8、lus sp.M1在BaP誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)處理下的樣本進行了轉(zhuǎn)錄組分析，探明了樣本的顯著差異基因，并進行了GO和KEGGpathway富集分析，闡明了M1代謝BaP可能的機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BaP誘導(dǎo)處理(M1P)樣品表達了差異基因1354個，其中上調(diào)基因947個，下調(diào)基因407個;M1中與鄰苯二酚、龍膽酸、原兒茶酸代謝相關(guān)的上調(diào)基因序列為BW16_RS10855、BW16_RS15195、BW16_RS03085、BW16_RS01690、B

9、W16_RS04980。GO分析功能注釋中功能酶基因包括作用于醛、雙酚類物質(zhì)、醌類物質(zhì)、過氧化物、CH-CH、CH-OH的氧化還原酶、C-C、C-N、C-O裂解酶，NADH脫氫酶（醌），?；D(zhuǎn)移酶和過氧化物酶活性;KEGG pathway分析中發(fā)現(xiàn)了碳水化合物代謝途徑、芳香化合物代謝、雜環(huán)化合物代謝以及萘代謝路徑。且在芳香化合物代謝途徑和萘代謝途徑中發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚、龍膽酸、原兒茶酸的代謝路徑，佐證了M1通過水楊酸和鄰苯二甲酸代謝BaP。<