家蠶乙醇脫氫酶的分子克隆及枯草芽孢桿菌子表面展示.pdf

1、乙醇脫氫酶屬于氧化還原酶家族,能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為輔酶,催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)。乙醇脫氫酶在很多生理過程中都起著重要作用,參與例如類固醇、類維生素A、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、脂肪酸、乙醇等代謝過程。目前,人們已經(jīng)鑒定了多種生物的乙醇脫氫酶基因,但是家蠶乙醇脫氫酶基因(Bombyx mori alcohol dehydrogenases,BmADH)還未見相關(guān)的報(bào)道。
　　 本研究首

2、先對家蠶乙醇脫氫酶基因BmADH進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并使其在大腸桿菌中表達(dá),通過檢測酶活性發(fā)現(xiàn)BmADH蛋白活力易受pH、溫度影響。為了獲得在極端條件下催化活性更高的酶蛋白,本研究借助枯草芽孢桿菌在極端的溫度、干燥以及暴露于有機(jī)溶劑和其他毒性化學(xué)物質(zhì)等不利條件下能長期存活的性質(zhì),首次利用分子生物學(xué)方法將家蠶乙醇脫氫酶展示在枯草芽孢桿菌芽孢表面,獲得融合蛋白CotC-BmADH。研究結(jié)果如下:
　　 1.通過生物信息學(xué)方法分析了

3、家蠶BmADH,結(jié)果表明,該基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子,開放閱讀框全長822 bp,編碼274個氨基酸,預(yù)測分子量約為29.6 kDa,等電點(diǎn)約為8.21。
　　 2.設(shè)計(jì)引物通過PCR擴(kuò)增出了家蠶BmADH編碼序列,克隆并利用pET-30a表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),所得融合蛋白通過質(zhì)譜和Western blotting鑒定為目標(biāo)蛋白。經(jīng)Ni-NTA純化系統(tǒng)純化后用于免疫新西蘭大白兔,制備抗BmADH蛋

4、白的血清。
　　 3.使用紫外分光光度計(jì)檢測經(jīng)過非變性純化后的重組家蠶BmADH在不同pH值和溫度條件下的酶活力。檢測結(jié)果表明,BmADH對環(huán)境條件敏感,如遇pH值或溫度不適則活力明顯降低甚至失活。
　　 4.將家蠶乙醇脫氫酶基因BmADH與芽孢表面蛋白基因CotC重組,構(gòu)建融合表達(dá)CotC-BmADH韻整合型重組質(zhì)粒pJS700-BmADH。
　　 5.用融合表達(dá)BmADH的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bacillus sub