生防菌枯草芽孢桿菌CQBS03的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記及其在柑橘葉片上的定殖.pdf

1、隨著生物防治技術(shù)的不斷發(fā)展，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在生物防治中的作用愈來愈受到重視。但是人們對于生防菌株的作用機(jī)理、生防菌與其靶標(biāo)菌株以及其寄主植物的關(guān)系等的認(rèn)識還是非常有限。建立穩(wěn)定、高效、遺傳轉(zhuǎn)化體系完善的標(biāo)記系統(tǒng)，對于更好的發(fā)揮生防菌株的作用，了解其在實(shí)際應(yīng)用中的微生態(tài)行為，有著非常重要的意義。
　　 生防菌枯草芽孢桿菌CQBS03是本實(shí)驗(yàn)室從柑橘植株葉面分離到的一株具有廣譜拮抗作用的細(xì)菌菌株。

2、前期的研究表明枯草芽孢桿菌CQBS03對柑橘潰瘍病菌、柑橘青霉、柑橘綠霉、柑橘炭疽菌、柑橘芽枝霉、玉米青枯病菌等多種植物病原菌都有明顯的抑制作用。本研究試圖應(yīng)用基因工程技術(shù)對生防菌枯草芽孢桿菌CQBS03進(jìn)行綠色熒光蛋白基因標(biāo)記，以研究其在柑橘植株葉片上的定殖能力，為利用該菌株進(jìn)行柑橘潰瘍病菌的生物防治奠定基礎(chǔ)。
　　 研究獲得以下主要成果：
　　 ①采用重疊PCR方法將p43啟動子和gfp進(jìn)行融合，并與大腸桿菌-枯草芽

3、孢桿菌穿梭載體pHY300PLK連接，構(gòu)建了攜帶gfp基因的重組質(zhì)粒pHY43G。
　　 ②重組質(zhì)粒以電脈沖轉(zhuǎn)化生防菌株 CQBS03，培養(yǎng)后于熒光顯微鏡下觀察并通過 SDS-PAGE 分析工程菌株 GFP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示重組菌能夠高效表達(dá)GFP，電泳后出現(xiàn)約 29 kDa的綠色熒光蛋白特異條帶；在熒光顯微鏡下可以看到轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)生明顯的綠色熒光。證明轉(zhuǎn)化成功，外源的綠色熒光蛋白可以在生防菌株 CQBS03 中高效表達(dá)。

4、>　　 ③對獲得的工程菌株進(jìn)行了柑橘潰瘍病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)、生長動力學(xué)分析、穩(wěn)定性測試。結(jié)果顯示，外源質(zhì)粒對宿主菌的生長未帶來明顯不利影響，室內(nèi)平板抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 CQBS03-pHY43G 生防效果與出發(fā)菌株沒有明顯差異（P<0.01），質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明重組質(zhì)粒 pHY43G（連續(xù)稀釋培養(yǎng) 30 代）穩(wěn)定性為 55％。認(rèn)為新構(gòu)建的基因工程菌可以滿足作物特定生育期，甚至一年生作物全生育期研究的需要。
　　 ④生防菌能否在植株上

5、定殖已成為評價生防菌優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。研究采用葉片噴霧方法接種，平皿稀釋分離培養(yǎng)方法測定 CQBS03-pHY43G在柑橘葉片上的定殖情況。在柑橘葉片噴施 CQBS03-pHY43G菌株制劑后，定期取樣用熒光顯微電鏡和 PCR 檢測回收菌落。結(jié)果表明：CQBS03-pHY43G在柑橘葉片上的種群數(shù)量為 6.80×104 cfu/g，15天后菌株在柑橘葉片上的種群數(shù)量下降到 2.03×
　　 104 cfu/g，然后下降速度稍緩