枯草芽孢桿菌OKB105菌株在番茄根表定殖機(jī)制研究.pdf

1、定殖是根圍促生細(xì)菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）發(fā)揮促生和生防作用的重要前提條件之一。至今人們對(duì)PGPR在作物上定殖的了解多局限于定殖形態(tài)位置和定殖水平高低，對(duì)涉及的基因和分子機(jī)制知之甚少，在芽孢桿菌領(lǐng)域尤為如此。本研究從以下4個(gè)方面對(duì)芽孢桿菌在番茄根表定殖的機(jī)制進(jìn)行探討。1）枯草芽孢桿菌OKB105在番茄根表定殖突變體篩選和定殖相關(guān)基因鑒定;2）Swarming是影響枯草芽孢桿菌

2、OKB105在番茄根表定殖的重要因素;3）yczE基因有助于芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞忍耐致死高溫和解淀粉芽孢桿菌FZB42 swarming運(yùn)動(dòng);4）3株枯草芽孢桿菌在番茄根表的定殖動(dòng)態(tài)以及對(duì)促生和生防效果的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 1)在進(jìn)行定殖篩選之前，先對(duì)OKB105菌株突變體文庫中的600個(gè)突變體進(jìn)行營養(yǎng)缺陷型篩選，從中剔除了11個(gè)營養(yǎng)缺陷型突變體。將剩余的589個(gè)突變體采用MS瓊脂無菌系統(tǒng)和石英砂無菌系統(tǒng)進(jìn)行定殖突變體的

3、篩選，獲得了9株在番茄根尖表現(xiàn)出定殖能力缺陷的突變體，并且這9個(gè)突變體在溫室盆栽定殖試驗(yàn)中同樣定殖缺陷。Southern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9個(gè)突變體中有6個(gè)是單基因位點(diǎn)突變，其中有3個(gè)突變體的轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)相同。通過反向PCR等方法從9個(gè)突變體中獲得7個(gè)插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，對(duì)側(cè)翼序所在基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明其中4個(gè)基因的片段長(zhǎng)度增加了與轉(zhuǎn)座元件片段長(zhǎng)度相同的1500bp，測(cè)序和序列比對(duì)后在基因的內(nèi)部找到了轉(zhuǎn)座元件插入的位置。此外，采用同源重

4、組雙交換方法將這4個(gè)基因分別定點(diǎn)突變后，突變體的定殖水平同樣表現(xiàn)出定殖能力缺陷，再次證實(shí)了這4個(gè)基因參與了枯草芽孢桿菌OKB105在番茄根表的定殖過程。這4個(gè)基因分別為:lysC基因，參與半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝，能夠感應(yīng)賴氨酸水平，受饑餓響應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控;bltR基因，轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一個(gè)廣義的外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng);yjbQ基因，編碼細(xì)胞膜上的N/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)的pH和鈉離子的平衡;minJ基因，二分裂拓?fù)鋵W(xué)因子，破壞后形成絲線狀的多

5、核細(xì)胞并失去群集運(yùn)動(dòng)(Swarming)能力。它們影響定殖的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　 2)本部分研究枯草芽孢桿菌OKB105的swarming對(duì)定殖的影響。鑒于OKB105的swarming調(diào)控基因swrA基因退化成了2個(gè)swrAA殘基，延遲了swarming的啟動(dòng)。首先將解淀粉芽孢桿菌FZB42的swrA基因整合到了OKB105菌株的amyE基因中獲得了swarming能力正常的衍生菌株SWR01。以SWR01菌株為對(duì)象研

6、究swarming以及其它二個(gè)曾被報(bào)道影響定殖的因素鞭毛和surfactin，三者對(duì)定殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，swrA、表面活性素編碼基因srfAC和鞭毛編碼基因hag被突變后均能影響該菌株在半固體平板上的swarming能力，同時(shí)顯著地降低菌株在番茄根表的定殖水平，并且swarming能力與在根表的遷移能力成正相關(guān)關(guān)系。經(jīng)分析表明，鞭毛、swarming和surfactin都對(duì)定殖水平產(chǎn)生重要影響，但是究其原因，鞭毛和surfactin均

7、是通過影響swarming間接地影響定殖的，swarming是重要的影響定殖的直接因素。
　　 3)本部分研究一個(gè)被推測(cè)可能與定殖相關(guān)的yczE基因的功能。該基因的功能未知，編碼一個(gè)假定的跨膜蛋白。構(gòu)建了解淀粉芽孢桿菌FZB42、CO6和枯草芽孢桿菌OKB105等3個(gè)菌株的yczE基因突變體，并檢測(cè)了yczE基因?qū)ρ挎邨U菌一些性狀的影響。發(fā)現(xiàn)了2個(gè)受yczE基因影響的性狀:(1)yczE基因有助于芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞忍耐致死高溫。在

8、SSM產(chǎn)孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h（吸光度OD600=1.4～1.9）階段，突變體在高溫處理后(80℃，20 min)活細(xì)胞數(shù)量只有野生型的5％～10％。一般認(rèn)為，芽孢桿菌耐受高溫是因?yàn)楫a(chǎn)生芽孢，但是芽孢染色沒有檢測(cè)到成熟的芽孢，表明該時(shí)期可能是產(chǎn)孢前期或者更早。通過qRT-PCR檢測(cè)產(chǎn)孢前期以及一些其他細(xì)胞分化途徑的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)突變體的基因表達(dá)水平相當(dāng)于親本菌株的0.44～2.31倍，表明yczE基因幾乎不影響產(chǎn)孢等細(xì)胞分化途徑，其作

9、用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。(2) FZB42菌株的yczE突變體swarming速度減慢，但OKB105和CO6并沒有受到影響。據(jù)報(bào)道影響swarming速度的主要因素是鞭毛數(shù)量和表面活性物質(zhì)的含量。鞭毛染色試驗(yàn)沒有檢測(cè)到y(tǒng)czE突變體的鞭毛數(shù)目變化;溶血試驗(yàn)和質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，突變體的表面活性物質(zhì)的產(chǎn)量下降但是主要的表面活性物質(zhì)的種類并沒減少。所以，我們認(rèn)為表面活性物質(zhì)產(chǎn)量降低是突變體swarming速度下降的直接因素。另外，本研究還

10、檢測(cè)了yczE基因?qū)σ志镔|(zhì)的影響。平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)菌株的yczE突變體對(duì)于水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)和油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)的抑制能力均沒有明顯改變，同時(shí)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明突變體產(chǎn)生的脂肽類化抗生素的種類也沒有減少，說明絕大部分抑菌物質(zhì)的合成均幾乎不受yczE基因的影響。
　　 4)本論文還對(duì)3株枯草芽孢

11、桿菌168、OKB105和OKB105Harpin在番茄上定殖動(dòng)態(tài)以及對(duì)促生作用和生防效果的影響進(jìn)行了研究。168是枯草芽孢桿菌模式菌株，OKB105是168衍生菌株能夠產(chǎn)生大量的脂肽類抗生素surfactin，OKB105Harpin是本實(shí)驗(yàn)室在OKB105的基礎(chǔ)上構(gòu)建的工程菌能夠表達(dá)植物生防因子Harpin。為了便于檢測(cè)這3個(gè)菌株在番茄根部的定殖情況，用攜帶綠色熒光蛋白(Green FluorescentProtein，GFP)的穿

12、梭載體pAD43-25對(duì)這3株菌株進(jìn)行標(biāo)記。經(jīng)檢測(cè)，該標(biāo)記載體在宿主菌中能穩(wěn)定遺傳，并且對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)發(fā)育沒有明顯的影響。在番茄根表的定殖結(jié)果表明，在灌根處理后的35天中，3個(gè)菌株在番茄根部定殖數(shù)量波動(dòng)一致，均是先呈拋物線趨勢(shì)然后維持在一個(gè)平穩(wěn)的水平，它們的定殖密度均在同一數(shù)量級(jí)(104～105CFU/cm)但也存在差異，OKB105定殖密度最高，OKB105Harpin次之，168最低;3個(gè)菌株在番茄根表定殖的位置和形態(tài)完全一致，在根