球毛殼菌與綠色木霉的熒光標(biāo)記及生防特性研究.pdf

1、球毛殼菌與綠色木霉均為重要的生防真菌。研究它們的生防特性不僅有助于我們進(jìn)一步了解其生防機(jī)理，還可以對(duì)相關(guān)真菌病害的防治，以及對(duì)于了解其它生防真菌的研究起到推動(dòng)作用。構(gòu)建報(bào)告基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效途徑。 本研究?jī)?yōu)化了生防真菌球毛殼菌原生質(zhì)體制備與再生條件，一方面研究了裂解酶種類、酶解溫度與時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑、菌齡、裂解緩沖液等因素對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響，另一方面研究了再生培養(yǎng)基類型、滲透壓穩(wěn)定劑與酶解時(shí)間等因素對(duì)原生質(zhì)

2、體再生的影響。通過(guò)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)、原生質(zhì)體活率測(cè)定、再生率統(tǒng)計(jì)等確定了原生質(zhì)體制備的最佳條件，即108個(gè)球毛殼菌孢子在250mlCM培養(yǎng)基中25℃，150rpm培養(yǎng)2-2.5d，過(guò)濾取菌絲，在以1％溶壁酶和1.5％蝸牛酶為裂解酶，以0.6MKCl為滲透壓穩(wěn)定劑，以pH=6.0的磷酸鹽緩沖液為裂解緩沖液的酶解液中，30℃100rpm酶解2h。過(guò)濾離心，將原生質(zhì)體在0.6MKCl中洗滌3次，在以0.76M蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑的OCM培養(yǎng)基中再生

3、。最終得到原生質(zhì)體產(chǎn)量為108原生質(zhì)體/g菌絲，活率和再生率分別高達(dá)98.15％和62.93％，滿足原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的數(shù)量和質(zhì)量要求。 構(gòu)建了2個(gè)EGFP表達(dá)載體和一個(gè)EYFP表達(dá)載體，并成功地將重組載體pBES和啟動(dòng)子陷阱載體pES轉(zhuǎn)化到球毛殼菌原生質(zhì)體中，將重組載體pCSN43-hph-EYFP轉(zhuǎn)化到綠色木霉原生質(zhì)體中，得到熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)幾輪驗(yàn)證篩選，包括選擇性平板篩選、PCR擴(kuò)增目的片段驗(yàn)證、Southern雜交驗(yàn)證插

4、入片段拷貝數(shù)、熒光鏡檢等，確認(rèn)EGFP基因/EYFP基因已經(jīng)插入球毛殼菌/綠色木霉基因組并在其中表達(dá)標(biāo)記。各取一個(gè)確認(rèn)為熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化子的菌株，進(jìn)行生防特性分析。主要通過(guò)平板共培養(yǎng)、載玻片對(duì)峙培養(yǎng)等方法初步研究了球毛殼菌/綠色木霉與植物病原真菌的拮抗機(jī)理。綠色木霉的主要抑制機(jī)理是對(duì)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)空間的強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)作用和重寄生作用。而對(duì)球毛殼菌報(bào)道較多的是抗生物質(zhì)的分泌和競(jìng)爭(zhēng)作用對(duì)病原真菌起抑制作用。但是本研究通過(guò)熒光鏡檢GFP標(biāo)記的球毛殼菌與病原