攜帶GFP綠色熒光標記的重組BAC-HSV-1HF株的構建及其子代病毒的特性研究.pdf

1、單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1)是一種重要的人類致病原，可導致從輕度的皮膚感染到致命性腦炎等不同程度的多種疾病。HSV-1基因組是一個包含有152 kbp堿基的雙鏈線性DNA，其基因組包括至少75種蛋白編碼基因。盡管目前HSV-1的大部分結構基因已經(jīng)研究清楚，然而仍有很多病毒基因的功能未被闡明，同時其順式作用元件如何調控基因的表達以及基因與基因之間的相互作用也不十分清楚，問題的困難性最

2、終體現(xiàn)在HSV-1龐大而復雜的基因組上。其龐大而復雜的基因組使其在真核細胞內的基因操作如定點基因的突變及某些基因的靶向敲除變的十分困難，從而不利于HSV-1各基因功能的研究。近幾年來發(fā)展的以細菌人工染色體為基礎的可攜帶大片段外源DNA的全新技術可使HSV-1全基因組以BAC(Bacterial artificial chromosome)質粒的形式在大腸桿菌中進行保存、增殖和遺傳修飾。與在真核細胞中進行的操作相比，HSV-1全基因組以質

3、粒的形式在大腸桿菌中進行的操作具有簡單快速、安全性好的優(yōu)點。BAC-HSV-1質粒轉染真核細胞后可重建具有感染性的HSV-1子代病毒，從而可促進HSV-1整個基因組中不同基因功能的研究。
　　 本實驗利用大腸桿菌的F因子即BAC，在真核細胞內利用同源重組的方法成功構建了含HSV-1全基因組的BAC-HSV-1，其重組部位為HSV-1的復制非必須基因，且BAC的兩端含有同向的loxP位點，經(jīng)Cre酶作用后，可以產(chǎn)生不含BAC的子代

4、重組病毒，使得對單純皰疹病毒的各基因功能分析及遺傳分析提升到了一個新的階段，為進一步研究該病毒株的性質奠定了堅實的基礎。
　　 目的：
　　 1.構建由BAC攜帶的HSV-1質粒及攜帶綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)的重組型BAC-HSV-1HF株感染性子代病毒；
　　 2.探討B(tài)AC-HSV-1HF株重組病毒的復制增殖能力；
　　 3.探討B(tài)AC-HSV-1HF株

5、重組病毒BAC元件的操作性。
　　 方法：
　　 1.構建BAC-HSV-1重組質粒
　　 (1)構建攜帶HSV-1同源臂的質粒C223-左右同源臂質粒以HSV-1 UL43-47的側翼序列為模板設計引物，擴增同源重組用HSV-1左右同源臂，將左右同源臂定向克隆至C223質粒的SacⅠ和NotⅠ位點，構建質粒C223-左右同源臂DNA。
　　 (2)C223-左右同源臂與HSV-1同源重組MluⅠ酶切C2

6、23-左右同源臂，使其線性化，脂質體包埋法將線性化的C223-左右同源臂DNA片段轉染至Vero細胞，24小時后，用MOI=0.01的HSV-1病毒感染Vero細胞，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)真核細胞內同源重組產(chǎn)生含GFP報告基因的BAC-HSV-1重組病毒。
　　 (3)噬斑純化篩選攜帶綠色熒光報告基因的BAC-HSV-1重組病毒，Hirt法提取BAC-HSV-1環(huán)形DNA，電轉化重組病毒環(huán)形DNA至DH10B感受

7、態(tài)菌中，挑取BAC-HSV-1重組質?？寺?，經(jīng)PCR和酶切法鑒定BAC-HSV-1重組質粒。
　　 2.質粒型BAC-HSV-1子代病毒的重建與特性研究
　　 (1)重組病毒BAC-HSV-1重建與特性研究將實驗組BAC-HSV-1和對照組HSV-1基因組DNA以脂質體包埋法各轉染2ugDNA至Vero細胞，48小時后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況和綠色熒光蛋白表達情況。72小時后收取細胞上清液，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(

8、50％tissue culture infective dose，TCID50)法測定兩組病毒滴度，將收獲的實驗組和對照組的子代病毒以MOI=0.01再次感染Vero細胞，TCID50法測定兩組病毒滴度。兩組將病毒滴度采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS16.0軟件分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 (2)重組病毒BAC-HSV-1中BAC的可操作性研究實驗組A組Vero細胞給予MO

9、I=2的重組復制缺陷型腺病毒Adv-Cre，18h后，以MOI=0.01的BAC-HSV-1重組病毒感染Vero細胞；實驗組B組Vero細胞給予MOI=2的重組復制缺陷型腺病毒Adv，18h后，以MOI=0.01的BAC-HSV-1病毒感染Vero細胞。觀察細胞生長情況，待各組細胞出現(xiàn)完全CPE后收集病變細胞上清液，將收集的病變細胞上清液于-80℃和37℃之間凍融3次，3000rpm/min離心10分鐘，各取10ul上清液分別感染Ver

10、o細胞，24h后，熒光3000rpm/min離心10分鐘，各取10ul上清液分別感染Vero細胞，24h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。
　　 結果：
　　 1.成功構建了HSV-1 HF病毒株的BAC-HSV-1質粒-病毒穿梭系統(tǒng)；
　　 2.BAC-HSV-1重組病毒在Vero細胞的復制增殖能力與原HSV-1病毒相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.079)：
　　 3.成功重建不含BAC元件的BAC-H