TLP表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)HeLa細(xì)胞周期調(diào)控作用的研究.pdf

1、TLP(TATA-box binding protein like protein)是TBP(TATA-box bindingprotein)家族蛋白中重要的一員，其C端保守區(qū)的結(jié)構(gòu)與TBP極為相似，在各種組織中廣泛表達(dá)。大量的研究表明，它在后口動(dòng)物的胚胎發(fā)育、精子形成及細(xì)胞凋亡等方面起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。但對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制尚無(wú)充分研究。本論文研究了TLP對(duì)HeLa細(xì)胞的調(diào)控作用，初步探明:TLP能抑制HeLa細(xì)胞的增殖，并通過(guò)

2、抑制CDK1和CyclinB1的表達(dá)，將其細(xì)胞周期阻滯于G2期。
　　首先，從LO2細(xì)胞中克隆出TLP基因的全長(zhǎng)CDS序列，將其插入到pEGFP-N1載體中，該載體中含有的GFP(Green Fluorescent Protein)基因是由野生型的GFP基因經(jīng)過(guò)光譜紅移突變得來(lái)，這種突變使得該載體能產(chǎn)生更加明亮的綠色熒光，且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效地表達(dá)。隨后，在大腸桿菌中擴(kuò)增該重組質(zhì)粒;抽提出質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBan

3、k中TLP序列完全一致，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　然后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中熒光，來(lái)研究pEGFP-TLP和pEGFP-N1是否轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞以及在細(xì)胞中的表達(dá)情況。正常條件下，轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，激發(fā)光激發(fā)后能發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，表明外源基因在細(xì)胞中得到有效地表達(dá)。另外，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間后，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。研究結(jié)果表明，TLP基因成功轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中，并在HeLa細(xì)胞中

4、表達(dá)。
　　其次，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)TLP對(duì)HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、LO2細(xì)胞、Hek293細(xì)胞及HL60細(xì)胞增殖水平的影響，結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞對(duì)TLP的作用最敏感。同時(shí)，細(xì)胞核染色也證明了這一結(jié)論，表現(xiàn)在核染色加深、核膜皺縮。另外，使用siRNA抑制TLP基因表達(dá)，研究結(jié)果顯示，TLP的表達(dá)沉默可逆轉(zhuǎn)TLP對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　最后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)TLP的HeLa細(xì)胞周期各時(shí)相分布，表明

5、:過(guò)表達(dá)TLP的HeLa細(xì)胞其G2期明顯延長(zhǎng)。通過(guò)RT-PCR和Western blot對(duì)HeLa細(xì)胞中周期相關(guān)基因CDK1、CDK2、CDK4、CyclinB1、CyclinD1和CyclinE1的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明:TLP能抑制CDK1和CyclinB1基因的表達(dá)。
　　綜上所述，本論文通過(guò)構(gòu)建TLP表達(dá)載體及后續(xù)研究，初步探明TLP通過(guò)抑制周期特異性基因CDK1和CyclinB1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，將HeLa細(xì)胞周期阻滯