人類p100蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人類p100蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究姓名：何津巖申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：姚智20080501天津醫(yī)科火學(xué)博士學(xué)位論文I)，分別于釋放后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞，PI染色，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)二使用MTS法p100蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞體外增殖能力的影晌。實(shí)驗(yàn)三，探討p100蛋白與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的關(guān)系。從啟動(dòng)子芯片以及基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果中挑選出兩個(gè)蛋白作為研究對(duì)象叫hkl

2、及CDKN2C(p18)，分別采用Westernblotting和RealtimePCR法，以pactin和GAPDH為內(nèi)參，觀察比較在p100過表達(dá)和抑制表達(dá)的情況下，CDKN2C和Chkl的蛋白水平和rnRNA水平有何差異。結(jié)果：第一部分，啟動(dòng)子芯片提示，p100蛋白可與幾個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因(如Chkl，CDKN2A，E2F1，RB等)的啟動(dòng)子具有較高的結(jié)合親和力。第二部分研究中構(gòu)建了能表達(dá)siRNA的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

3、后，經(jīng)G418篩選出抑制p100蛋白表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株HeLap100I，Westernblotting鑒定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定株之p100蛋白表達(dá)抑制率分別為4759％和6286％。第三部分實(shí)驗(yàn)一結(jié)果表明，p100蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞周期有影響：p100蛋白過表達(dá)或抑制表達(dá)時(shí)均使HeLa細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例增加，G2期和S期細(xì)胞比例減少。實(shí)驗(yàn)二結(jié)果顯示，當(dāng)p100蛋白過表達(dá)時(shí)促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖；在瞬時(shí)抑制p100蛋白表達(dá)時(shí)則抑制細(xì)胞增殖。實(shí)

4、驗(yàn)三結(jié)果顯示：在HeLa細(xì)胞中，①p100蛋白下調(diào)CDKN2C(p18)蛋白表達(dá)：瞬時(shí)或穩(wěn)定抑制p100蛋白表達(dá)均可顯著提高CDKN2C(p18)的蛋白水平和mRNA水平。而p100蛋白過表達(dá)時(shí)CDKN2C(p18)的蛋白水平降低。②p100蛋白上調(diào)Chkl蛋白表達(dá)：當(dāng)p100蛋白過表達(dá)時(shí)，Chkl蛋白水平升高；反之，亦然。結(jié)論：1p100蛋白與HeLa細(xì)胞周期相關(guān)，鑒于p100蛋白過表達(dá)或抑制表達(dá)均使HeLa細(xì)胞Gl期比例增加，故認(rèn)為