p66shcA基因?qū)C12細(xì)胞周期的影響.pdf

1、Shc家族有3個(gè)成員：ShcA，ShcB，ShcC。ShcA是其中最早發(fā)現(xiàn)的分子，在1992年被發(fā)現(xiàn)作為受體蛋白偶聯(lián)到被激活的表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR上參與有絲分裂原活化的蛋白激酶MAPK通路，該基因只在神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，但在成年個(gè)體中除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外在機(jī)體周身表達(dá)，ShcB/ShcC只限在成年個(gè)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。ShcA編碼3個(gè)分子量相近的蛋白52kDa(p52ShcA)、46kDa(p46ShcA)和66kDa(

2、p66ShcA)，它們都具有Shc家族特有的高度保守結(jié)構(gòu)域，即C段Src同源結(jié)構(gòu)域SH2，N段的磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域PTB，和膠原同源區(qū)CH1。p52ShcA/p46ShcA共用一個(gè)啟動(dòng)子，可以偶聯(lián)到被激活的受體酪氨酸蛋白激酶RPTK，參與Ras/MAPK通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。p66ShcA是ShcA最長(zhǎng)的剪接體，具有特有的N段結(jié)構(gòu)域，稱作CH2，在36位包含一個(gè)磷酸蘇氨酸位點(diǎn)，該位點(diǎn)是一個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，影響p66ShcA基因的功能。

3、 為了研究p66shcA基因如何在神經(jīng)發(fā)育分化過程中啟作用，我們以PC12為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以脂質(zhì)體法將pEGFP-N1-shcA真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期分布的變化；RT-PCR檢測(cè)p27mRNA的表達(dá)變化。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和空載體組相比，轉(zhuǎn)染mp66shcA后，處于G0/G1期的PC12細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.01)，而G2/M期的細(xì)胞百分比明顯降低(P<0.01)；在mRNA水平上，

4、轉(zhuǎn)染：mp6shcA的p27的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明，mp66shcA基因影響神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖。 為了確定p66shcA基因在NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化過程中是否啟促進(jìn)作用。我們用G418篩選轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定克隆，比較在NGF作用下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分化程度的快慢。由于該基因有誘導(dǎo)凋亡的作用，無法得到穩(wěn)定克隆，但在NGF誘導(dǎo)兩天的條件下，過表達(dá)目的基因的PC12細(xì)胞，與對(duì)照組細(xì)胞相比，確有明顯分化的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)，