初級(jí)纖毛對缺氧環(huán)境下PC12細(xì)胞抗氧化活性的影響.pdf

1、目的：研究缺氧環(huán)境中PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛長度發(fā)生變化的規(guī)律及初級(jí)纖毛對PC12細(xì)胞在缺氧環(huán)境下抗氧化活性的影響。
　　方法：1、采用物理性缺氧及氯化鈷模擬化學(xué)缺氧方法分別對PC12細(xì)胞進(jìn)培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)時(shí)間分別0h、6h、18h，然后通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化情況并比較兩種缺氧方式對PC12細(xì)胞造成的損傷程度，同時(shí)通過免疫熒光染色法觀察并對比兩種缺氧培養(yǎng)方式下PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛的發(fā)生情況，確定一種為本實(shí)驗(yàn)中將采用的缺氧方

2、法。
　　2、對PC12細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)時(shí)間分別0h、6h、18h，于不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞初級(jí)纖毛形態(tài)并測量其長度，研究缺氧培養(yǎng)前后，PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛發(fā)生率及纖毛長度的變化規(guī)律。
　　3、對PC12細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，于缺氧0h及18h后采用免疫熒光染色法觀察HIF-1α、HIF-2α及Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況，同時(shí)于缺氧0h、6h、18h后采用RT-PCR法及WesternBlot法分別檢測HIF-1α、Nrf2、V

3、EGF及SOD的基因及蛋白表達(dá)情況。
　　4、采用RNAi干擾法抑制IFT88的表達(dá)從而干擾細(xì)胞初級(jí)纖毛的發(fā)生，通過檢測IFT88的基因和蛋白表達(dá)情況以及初級(jí)纖毛的鏡下觀察來確認(rèn)干擾效果，從而建立起RNAi法抑制初級(jí)纖毛發(fā)生的方法。
　　5、對初級(jí)纖毛被抑制后的PC12細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)時(shí)間分別0h、6h、18h，于不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞初級(jí)纖毛形態(tài)并測量其長度，研究初級(jí)纖毛發(fā)生被抑制后，PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛在缺氧環(huán)境中

4、的發(fā)生率及纖毛長度的變化規(guī)律。
　　6、研究缺氧培養(yǎng)對胞內(nèi)缺氧相關(guān)因子HIF-1α、HIF-2α及Nrf2表達(dá)及發(fā)生核轉(zhuǎn)位的影響，闡明初級(jí)纖毛被干擾后，上述因子及胞內(nèi)HIF/HRE和Nrf2/ARE信號(hào)途徑在缺氧時(shí)的激活情況，并通過RT-PCR法及WesternBlot法檢測胞內(nèi)VEGF及SOD的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、物理性缺氧培養(yǎng)及氯化鈷模擬化學(xué)缺氧培養(yǎng)后6h后，PC12細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯形態(tài)變化；缺氧18h后，細(xì)胞形態(tài)

5、發(fā)生明顯變化，其中化學(xué)模擬缺氧培養(yǎng)后PC12細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，大部分細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮，導(dǎo)致缺氧培養(yǎng)后的PC12細(xì)胞的初級(jí)纖毛不再發(fā)生，無法觀察到缺氧時(shí)間與初級(jí)纖毛長度的相關(guān)性，因此本課題組確定采用物理性缺氧方法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2、隨著缺氧時(shí)間的增加，PC12細(xì)胞的初級(jí)纖毛的發(fā)生率顯著下降，常氧培養(yǎng)（缺氧0h）時(shí)，初級(jí)纖毛發(fā)生率為60.0％；缺氧6h后，初級(jí)纖毛發(fā)生率下降為55.3%；缺氧18h后，初級(jí)纖毛發(fā)生率為41.4%。

6、r>　　3、隨著缺氧時(shí)間的增加，PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛的長度顯著增長。未缺氧對照組初級(jí)纖毛的平均長度為0.64μm，缺氧6h試驗(yàn)組初級(jí)纖毛平均長度為1.34μm，缺氧18h試驗(yàn)組初級(jí)纖毛平均長度為2.02μm。
　　4、缺氧會(huì)引起PC12細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、HIF-2α、Nrf2發(fā)生明顯核轉(zhuǎn)位。
　　5、缺氧培養(yǎng)后胞內(nèi)HIF-1α、VEGF、Nrf2的表達(dá)量顯著增加，同時(shí)SOD表達(dá)量顯著降低。
　　6、IFT88表達(dá)被干

7、擾后，初級(jí)纖毛發(fā)生明顯受到抑制，初級(jí)纖毛變成短棒狀或斑點(diǎn)狀。初級(jí)纖毛被干擾后，缺氧處理不再引起初級(jí)纖毛長度和發(fā)生率發(fā)生變化。
　　7、當(dāng)PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛被干擾后，缺氧環(huán)境下，HIF-1α、Nrf2、VEGF的表達(dá)均受到顯著抑制，而SOD表達(dá)量無顯著變化。同時(shí)，缺氧也不再引起HIF-1α、HIF-2α及Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：1.缺氧可以引起PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛增長，并且隨著缺氧時(shí)間的延長，纖毛長度也隨之增加；但當(dāng)

8、IFT88蛋白的表達(dá)被干擾后，PC12細(xì)胞初級(jí)纖毛的發(fā)生會(huì)隨之被干擾，缺氧不再引起初級(jí)纖毛長度發(fā)生變化。
　　2.初級(jí)纖毛可以影響PC12細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的抗氧化活性，并通過一定途徑將缺氧信號(hào)導(dǎo)入胞內(nèi)，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞抗缺氧機(jī)制。
　　總之，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上觀察了缺氧時(shí)初級(jí)纖毛長度、形態(tài)和缺氧相關(guān)信號(hào)途徑的變化情況，發(fā)現(xiàn)缺氧可以使PC12細(xì)胞的初級(jí)纖毛長度出現(xiàn)顯著增加，同時(shí)激活胞內(nèi)抗缺氧相關(guān)的信號(hào)途徑。但當(dāng)用RNAi法干擾初級(jí)