人類p100蛋白與G3BP蛋白之間的結(jié)合與功能研究.pdf

1、目的:p100蛋白是一種多功能蛋白，是基因轉(zhuǎn)錄和pre-mRNA剪接加工的雙重調(diào)控因子，由4個重復(fù)的葡萄球菌核酸酶同源性結(jié)構(gòu)域SN片段和隨后的Tudor-SN(TSN)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。本課題小組在前期的工作中利用p100蛋白作為誘餌釣取可以與之結(jié)合的蛋白時釣到了G3BP蛋白。由此，我們提出疑問:p100蛋白與G3BP蛋白之間的結(jié)合是在某一種特定的環(huán)境下偶然地存在還是一種穩(wěn)定的細胞內(nèi)結(jié)合？兩種蛋白之間是直接結(jié)合還是需要其他的輔助成分進行橋接？

2、與結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域各位于兩種蛋白質(zhì)的哪一個部分？為了解決這些疑問，我們開展了關(guān)于p100蛋白與G3BP蛋白之間的相互結(jié)合的研究工作，并對結(jié)合后的潛在功能進行了初步的探討。
　　方法:
　　第一部分:p100蛋白與G3BP蛋白的結(jié)合研究。首先利用p100蛋白不同片段的GST融合蛋白釣取細胞內(nèi)過表達的G3BP蛋白以確認我們前期研究工作中發(fā)現(xiàn)的二者之間的結(jié)合關(guān)系。為了確定二者之間的結(jié)合關(guān)系是否穩(wěn)定，通過細胞內(nèi)過表達的p100蛋白

3、與G3BP蛋白之間及細胞內(nèi)源性p100蛋白與G3BP蛋白之間的免疫共沉淀實驗再次印證實驗一的結(jié)果。最后利用免疫熒光實驗觀察二者在細胞內(nèi)的定位情況。
　　第二部分: p100蛋白與G3BP蛋白相互結(jié)合的功能片段的確定。首先根據(jù)G3BP的結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建了表達G3BP不同結(jié)構(gòu)域的GST-G3BP片段融合蛋白表達質(zhì)粒和用于體外翻譯的帶有T7啟動子的pcDNA3.1(+)-G3BP質(zhì)粒。然后通過GST-Pull Down方法用GST-G3BP

4、片段1～5融合蛋白體外翻譯的p100蛋白，放射自顯影的方法觀察結(jié)果。反之，利用GST-p100片段融合蛋白釣取體外翻譯的G3BP蛋白，從而確定二者之間相互結(jié)合的功能片段。為了進一步驗證我們的實驗結(jié)果，重復(fù)GST-pullDown實驗部分，不同之處在于用GST融合蛋白釣取細胞內(nèi)過表達的蛋白質(zhì)，Western Blot方法檢測。
　　第三部分:p100蛋白與G3BP蛋白結(jié)合后的功能探討。通過免疫免疫熒光方法觀察共轉(zhuǎn)染pEGFP-CI-

5、G3BP與pRFP-p100/p100-SN/p100-TSN質(zhì)粒的HeLa細胞給予亞砷酸鹽刺激或熱休克刺激后，兩種蛋白質(zhì)在細胞中的共定位情況，并確定共定位的功能片段。同時研究p100蛋白與G3BP蛋白結(jié)合后對細胞內(nèi)mRNA代謝的影響:將COS7細胞分別轉(zhuǎn)染p100或G3BP或共轉(zhuǎn)p100與G3BP質(zhì)粒，給予亞砷酸鹽或45℃熱休克刺激后觀察細胞內(nèi)RNA降解情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:無論是細胞內(nèi)源性p100蛋白與G3B

6、P蛋白之間還是細胞內(nèi)過表達的p100蛋白與G3BP蛋白質(zhì)之間都可以發(fā)生共沉淀，表明p100蛋白和G3BP蛋白可以穩(wěn)定結(jié)合。在轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)觀察到p100蛋白與G3BP蛋白在細胞內(nèi)的定位基本一致，主要分布于胞漿內(nèi)，少量p100蛋白分布于胞核內(nèi)。
　　第二部分:p100蛋白的SN片段可以與G3BP蛋白的多個片段結(jié)合，包括NTF2-like片段、PxxP模序、RRM片段，RGG片段結(jié)合不穩(wěn)定。而p100蛋白的TSN片段和TD片段及G3B

7、P蛋白的酸性氨基酸富集區(qū)片段則與二者之間的結(jié)合無關(guān)。
　　第三部分:轉(zhuǎn)染后的細胞給予亞砷酸鹽刺激或熱休克刺激后，胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)綠色和紅色的熒光顆粒，二種熒光顆粒在胞漿中的定位基本一致。隨著刺激時間的延長，顆粒的數(shù)量和體積不斷發(fā)生變化。P100蛋白的SN片段在細胞內(nèi)可形成與G3BP共定位的顆粒，而TSN片段和空載體pEGFP-CI和pRFP在胞漿內(nèi)不能形成明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu)。熱休克刺激去除后，顆粒的數(shù)量和體積有一定的減少，其中紅色顆粒

8、的消散比較明顯。
　　細胞轉(zhuǎn)染了p100或G3BP或共轉(zhuǎn)p100與G3BP后，細胞內(nèi)提取到RNA與未轉(zhuǎn)染細胞之間無明顯差異。各組細胞在給予亞砷酸鹽或45℃熱休克前后的RNA代謝情況也未有明顯差異。
　　結(jié)論:通過研究證實，G3BP與p100蛋白在細胞內(nèi)、外均可結(jié)合，不需要輔助因子的參與。二者之間的結(jié)合是由G3BP的NTF2-like片段、PxxP模序、RRM片段和p100蛋白的SN片段介導(dǎo)的。應(yīng)激狀態(tài)下，p100蛋白與G3B