隔離子結(jié)合蛋白質(zhì)CTCF的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、CTCF(CCCTC-binding factor)最早是被作為Myc基因的表達抑制因子而發(fā)現(xiàn)的。CTCF全長蛋白質(zhì)由727個氨基酸組成，其中含有11個鋅指結(jié)構(gòu)域。CTCF在脊椎動物中是高度保守的，并通過結(jié)合DNA、蛋白質(zhì)來發(fā)揮功能，如介導募集cohesin，X染色體失活，異染色質(zhì)邊界的形成，V(D)J的重組，RNA(mRNA)剪切，凋亡等。CTCF通過鋅指之間的不同組合來識別高度變化的DNA序列，現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)表明，CTCF能夠結(jié)合數(shù)

2、以萬計的DNA片段，通過生物信息學分析可以得出長度約為20bp的共有序列。目前，關(guān)于CTCF的工作大部分集中在其結(jié)合DNA序列的生物信息學研究以及CTCT在表觀遺傳學中的重要作用。
　　我們利用基因工程技術(shù)獲得CTCF的表達質(zhì)粒，通過原核表達系統(tǒng)得到CTCF的可溶性表達，并經(jīng)親和層析，陽離子交換層析和分子篩得到了高純度的蛋白質(zhì)。螯合實驗發(fā)現(xiàn)鋅離子在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象以及蛋白質(zhì)和DNA相互作用中起重要作用。通過一系列凝膠遷移實驗，分析型

3、分子篩，分析型超速離心實驗，ITC實驗找到適宜與蛋白質(zhì)共結(jié)晶的DNA片段及結(jié)晶條件，利用結(jié)晶試劑盒在20℃的條件下得到蛋白質(zhì)-DNA復合物晶體。質(zhì)譜分析得到了結(jié)晶復合物中蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
　　本文通過一系列的生物化學實驗方法確定了能夠結(jié)晶的蛋白質(zhì)和DNA片段。質(zhì)譜結(jié)果可以看出只有部分鋅指結(jié)構(gòu)域參與到與DNA的結(jié)合當中，并且CTCF的N端也可能參與到蛋白質(zhì)與DNA間的相互作用中，這也為解釋CTCF與DNA相互作用提供了分子基礎(chǔ)。