Il-18和p100蛋白在鼻息肉形成過程中潛在作用機制的研究.pdf

1、目的:鼻息肉是鼻腔外側壁粘膜突入鼻腔形成的新生物，發(fā)病機制不明，其本質是粘膜的慢性持續(xù)性炎癥。白細胞介素18(IL-18)是近年來發(fā)現(xiàn)的前炎性細胞因子，在感染、炎癥、自身免疫性疾病、組織的炎性損傷等過程中發(fā)揮非常重要的調節(jié)作用。p100蛋白是一種多功能蛋白，它可與多種蛋白轉錄因子結合，廣泛的存在于各種組織細胞。然而，查閱文獻，未見IL-18和p100蛋白在鼻息肉中的表達情況的報道。由此，我們提出疑問:IL-18和p100在鼻息肉中的表達

2、情況如何呢？二者與鼻息肉的發(fā)病是否有關系呢？二者在鼻息肉的發(fā)病機制中到底扮演什么樣的角色呢？其深入的分子機制又是如何？此課題我們檢測IL-18和p100在鼻息肉中的表達情況，并進一步探討二者在鼻息肉形成過程中可能的作用機制。
　　 方法:
　　 第一部分:IL-18等細胞因子及p100蛋白在鼻息肉中的表達與定位。收集鼻息肉和正常鼻粘膜臨床標本，將其分為兩部分，一部分制作石蠟病理切片，進行HE及免疫組化染色，觀察鼻息肉炎細

3、胞構成及浸潤情況，觀察IL-18、p100蛋白在鼻息肉中的表達情況。另一部分液氮儲存，勻漿并變性蛋白后進行WesternBlotting檢測，在蛋白水平進一步的驗證IL-18、p100蛋白在鼻息肉中的表達情況。
　　 第二部分:IL-18在鼻息肉形成過程中可能作用機制的研究。這部分實驗中，我們以A549細胞系作為呼吸道上皮細胞的代表，以炎癥因子LPS，細胞因子IL-4刺激A549細胞，觀察IL-18的表達情況以明確上皮細胞在炎癥

4、狀態(tài)下是否會分泌IL-18等細胞因子以及上皮細胞分泌的細胞因子之間是否會相互調控，以進一步的證明IL-18參與了鼻息肉形成的病理機制，且上皮細胞可能是鼻息肉病理機制發(fā)生的“initiator”。
　　 第三部分:p100在鼻息肉形成過程中可能作用機制的。在這部分實驗中，我們將實驗分成兩個部分，(1) p100是否參與IL-4/STAT6和LPS/TLR4信號通路的研究;(2) p100是否參與增殖和細胞周期的研究。在第一部分實驗

5、中我們的技術路線是:在細胞水平，以LPS，IL-4刺激A549細胞，觀察IL-8，IL-6等細胞因子，STAT6，p100的表達變化情況。在動物水平，我們以OVA誘導小鼠哮喘模型以模擬IL-4/STAT6信號通路，以LPS誘導急性肺炎模型模擬LPS/TLR4信號通路，取小鼠肺組織，觀察支氣管上皮細胞p100表達情況。在第二部分實驗中我們又分為兩個小的實驗①p100與增殖狀態(tài)關系的初步研究和②p100與細胞周期相關轉錄因子c-Myc的關系

6、的研究，實驗①的技術路線是取小鼠不同增殖狀態(tài)的組織和不同增殖狀態(tài)的外周血細胞檢測p100蛋白的表達水平。實驗②的技術路線是第一，我們培養(yǎng)裂解hela細胞，分別以p100抗體釣取c-Myc蛋白，以c-Myc抗體釣取p100蛋白，WB檢驗釣取結果，以明確p100蛋白是否與c-Myc蛋白相結合。第二，以不同的質粒轉染hela細胞，建造p100過表達，和p100抑制的細胞模型，檢測c-Myc的表達情況，以視p100表達是否對c-Myc蛋白表達產(chǎn)

7、生影響。
　　 結果:
　　 第一部分:我們發(fā)現(xiàn)IL-18、IL-4、IFN-γ在正常鼻粘膜及鼻息肉的上皮層、腺體及間質的炎性細胞中均有表達，且在鼻息肉中表達增加，在嗜酸粒鼻息肉中表達增加更明顯，成熟型IL-18僅在鼻息肉中表達，而正常鼻粘膜中缺如。我們還發(fā)現(xiàn)p100蛋白在鼻息肉上皮層和腺體中也大量表達，但在80％的嗜酸粒細胞中表達缺失。
　　 第二部分:我們證實IL-18在上皮細胞系A549中表達，且在LPS刺

8、激下表達增加，成熟型IL-18僅在LPS刺激的A549細胞中表達，而正常A549中缺如。我們還發(fā)現(xiàn)IL-4能減弱IL-18在上皮細胞系A549中表達。細胞因子在上皮細胞的表達也可相互調控。
　　 第三部分:p100蛋白參與炎癥的機制可能是參與了IL-4/STAT6信號轉導通路，而沒有參與LPS/TLR4信號通路誘導的細胞因子生成過程。另外，p100蛋白可能與細胞周期密切相關，其參與細胞周期可能不是通過c-Myc途徑，而是通過其它

9、的信號通路。
　　 結論:IL-18、p100正常鼻粘膜及鼻息肉中均大量表達。IL-18在鼻息肉中表達增加，成熟型IL-18僅在鼻息肉中表達，而正常鼻粘膜中缺如。IL-18在鼻息肉的形成過程中可能發(fā)揮重要的作用。鼻粘膜上皮細胞可在致炎因素的刺激下分泌大量的細胞因子如IL-18、IL-4、IFN-γ等，鼻上皮細胞是接觸抗原的第一道屏障，可能是鼻息肉等疾病發(fā)生發(fā)展的“initiator”。p100蛋白通過IL-4/STAT6信號轉導