重組質(zhì)粒pAAV-CNTF—EGFP的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：克隆大鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(cniaryneul：3trohicfactor，CNTF)的開放讀碼框，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV-CNTF-EGFP，包裝攜帶CNTF重組腺相關(guān)病毒。 方法：1)克隆大鼠CNTFcDNA：選用健康成年sD(Sprague—Dawley，SD)大鼠，分離兩側(cè)坐骨神經(jīng)，利用Trizol試劑盒提取其總RNA：RT-PCR擴(kuò)增大鼠CNTFcDNA片段，克隆到pUcm-T載體(即pUcm-CNTF)。2)構(gòu)建

2、pAAV-EGFP質(zhì)粒：從pEGFP-N。中擴(kuò)增EGFPcDNA，經(jīng)SalI和BglII雙酶切后定向克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pAAV-MCS中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性重組子，構(gòu)建相應(yīng)的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-EGFP。3)構(gòu)建pAAV-CNTF—EGFP：CNTFeDNA插入到pAAV—EGFP中EGFP的上游，構(gòu)建攜帶CNTF和EGFP的重組AAV病毒載體：pAAV-CNTF—EGFP。4)重組質(zhì)粒的鑒定：應(yīng)用酶切分析及DNA測序鑒定插

3、入片斷與開放讀碼框的正確性。5)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pAAV-EGFP、pAAV—CNTF—EGFP分別和輔助質(zhì)粒pAAV-RC、pHelper共轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞。6)檢測融合蛋白CNTF—EGFP的表達(dá)：利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)法和Westernblot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CNTF的表達(dá)情況。 結(jié)果：克隆了大鼠CNTFcDNA，成功構(gòu)建了攜帶CNTF和EGFP的重組AAV病毒表達(dá)載

4、體，pAAV—CNTF—EGFP。重組質(zhì)粒pAAV-EGFP、pAAV-CNTF—EGFP分別和輔助質(zhì)粒pAAV-RC、pHelper共轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有綠色熒光；免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察到轉(zhuǎn)染pAAV-CNTF—EGFP細(xì)胞核及核周胞漿被染成棕黃色，而轉(zhuǎn)染空載體pAAV—EGFP和未轉(zhuǎn)染組的293細(xì)胞無明顯著色；WesternBlot結(jié)果進(jìn)一步證明構(gòu)建的pAAV-CNTF—EGFP載體能在293細(xì)胞