乙腦病毒非結構4A蛋白編碼基因重組構建與表達.pdf

1、目的：
　　 構建乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）非結構（non-structure，NS）4A蛋白編碼基因重組子，將其轉染中華倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞并用間接免疫熒光法探討該重組子的表達特征，為進一步研究JEV NS4A蛋白的生物學功能奠定基礎。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 （一）細胞、質粒及菌株

2、>　　 CHO細胞購自中國科學研究院上海細胞庫，生長于37℃，5％CO2及含10％胎牛血清（Fatal calf serum，F(xiàn)CS）的Dulbecco’modified eagle medium（DMEM）高糖培養(yǎng)液中；含F(xiàn)LAG片段的JEV NS4A蛋白編碼基因重組質粒被命名為pJNS4A由本實驗室構建；真核表達載體pcDNA3.1（+）購自Invitrogen公司，用于JEV NS4A蛋白編碼基因重組子的構建；大腸桿菌JM109

3、與DH5α購自Takara公司，用于重組質粒構建、轉化。
　　 （二）試劑及抗體
　　 RNA抽提試劑（Code No.D312），RT-PCR試劑盒（Code No.DR027A），DNA片斷純化試劑盒（Takara，product No.DV807），DNA A尾試劑盒（Takara，product No.D404），瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Takara，product No.DV805），DNA連接試劑盒（Ta

4、kara，product No.D6023），質粒小劑量提取試劑盒（Takara，product No.DV801A），限制性內切酶EcoRI、BamHI均購自Takara公司，用于重組質粒的構建和酶切鑒定。脂質體（Lipofectamine 2000）購自Invitrogen公司，用于轉染CHO細胞。氨芐青霉素購自Sigma公司，瓊脂糖購自Takara公司，用于質粒的轉化和電泳分析；DMEM高糖培養(yǎng)液，10％FCS，青霉素購自?？坡」?/p>

5、司，用于CHO細胞的培養(yǎng)；兔抗鼠IgG Fc（一抗），購自Cell Signaling公司，山羊抗兔（熒光二抗）購自北京中杉金橋公司，用于質粒轉染后的免疫熒光檢測。
　　 二、實驗方法
　　 （一）JEV NS4A蛋白編碼基因重組質粒構建與鑒定
　　 以JEV SA14-14-2株Total RNA為模板，運用RT-PCR方法擴增JEVNS4A基因片段，并在該基因片段的5’端加入FLAG序列，再在其兩側加入起始密

6、碼子與終止密碼子，最后在其兩側加入BamHI/EcoRI酶切位點。將反轉錄引物：5’GAATTCTTAGGCTCCTGCACAAGCT ATGAC3’及限制性內切酶EcoRI（-GAA TTC-）合成至JEV NS4A編碼基因5’末端。PCR法擴增前向引物5’GGATCCATGACTAAAAAACCAGGAGGGC3’，將BamHI（-GGA TCC-）合成至5’末端，反向引物為上述反轉錄引物。1％瓊脂糖凝膠電泳并回收最終PCR產物，后

7、者與pMD19-T simple連接構建重組子pMD-JNS4A。使用PrimeSTAR@HS DNA Polymerase（CodeNo.DR0-10S），對重組質粒CTB756-T-7為模板，以CTB906F（5’CGGGATCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGTCAGCCGTTAG CTTCATAG3’）為引物進行PCR擴增。將PCR擴增產物使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurific

8、ation Kit Vet.2.0（Code No.DV805A）進行切膠回收約900bp的片段后，使用BamHI/EcoRI進行酶切，經(jīng)乙醇沉淀后，命名為Insert DNA； 將質粒pcDNA3.1（+）使用BamHI/EcoRI進行酶切，然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code--No.DV805A）切膠回收約5.4kbp的DNA片段后，命名為Vector D

9、NA；使用TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution Ⅰ將Insert DNA和Vector DNA連接后，熱轉化至E.coli Competent Cell JM109（Code No.D9052）中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取質粒命名為CTB906-2，使用引物T7、BGHrev對上述質粒進行測序，結果正確。轉化pJNS4A于大腸桿菌DH5α，小劑量提取質粒

10、pJNS4A，并用BamHI/EcoRI酶切進行核酸電泳鑒定。
　　 （二）pJNS4A穩(wěn)定轉染CHO細胞
　　 采用脂質體穩(wěn)定轉染法即Lipofectamine 2000將pJNS4A轉染CHO細胞，同時設轉染空載體pcDNA3.1（+）的CHO細胞與未轉染的正常CHO細胞為陰性對照。
　　 具體方法為：
　　 1、轉染
　　 實驗前在6孔板中培養(yǎng)CHO細胞，待細胞生長濃度約90％-95％，即每

11、500ul含0.5-2.0×105/個。配制脂質體/質?；旌衔铮喝芤篈、B：分別將重組質粒pJNS4A和空載體pcDNA3.1（+）各8μg（每孔）加入DMEM培養(yǎng)液（不含胎牛血清）500ul中，溶液總體積各為250μl（每孔），輕輕混勻，標記；溶液C：將20μl脂質體加入500μl DMEM培養(yǎng)液中，共四管，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；分別將A與C，B與C液體混合，室溫放置20分鐘（這時溶液會變渾濁）以形成脂質體/質粒混合物；棄去6孔板

12、中的原液，向6孔板中逐滴加入上述混合液體，邊加邊搖動培養(yǎng)板，每孔2ml，做標記。在37℃，5％的CO2中培養(yǎng)4小時后，改用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2、篩選
　　 6孔板培養(yǎng)24小時后，改為24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。用含G418濃度依次為100、150、200，250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900ug/mL的DMEM培養(yǎng)。每種濃度設3

13、個孔，轉染空質粒的CHO細胞及正常CHO細胞為對陰性照組。培養(yǎng)15 d后，以能殺死所有正常CHO細胞的最低G418的濃度作為本實驗的最佳篩選濃度即為100 ug/m L，維持培養(yǎng)。
　　 （三）免疫熒光檢測
　　 將轉染pJNS4A的CHO細胞、轉染空載體的CHO細胞及正常的CHO細胞接種于6孔板中的蓋玻片，以蓋滿玻片不溢出為度，標記。于37℃，5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)待細胞密度達到約60％-70％時，4％多聚甲醛固定

14、細胞1 h，0.1％Triton X.100打孔10 min，10％BSA封閉1 h，兔抗鼠IgG Fc分別按1:800稀釋，4℃孵育過夜。FITC標記山羊抗兔IgG按1:00稀釋濃度，于37℃避光孵育1 h，50％甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察熒光標記。
　　 結 果
　　 1、JEV NS4A蛋白編碼基因構建
　　 （1）以JEV SA14-14-2株Total RNA為模板，經(jīng)重組構建含有FLAG片段的JEV

15、 NS4A 蛋白編碼基因重組子pJNS4A。經(jīng)酶切鑒定表明：重組質粒經(jīng)BamHI/EcoRI酶切釋出的插入子與pJNS4A經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致，均約為900bps，使用引物T7、BGHrev對上述質粒進行測序，含有JEV NS4A蛋白編碼基因片段，證明質粒構建成功。
　　 （2）將pJNS4A在感受態(tài)大腸桿菌中擴增，提取質粒RNA，行核酸電泳對其鑒定?？梢娫诩s900bps的位置上有一明顯條帶，證明質粒構建成功。

16、
　　 2、JEV NS4A蛋白編碼基因重組質粒轉染CHO細胞免疫熒光鑒定
　　 轉染pJNS4A的CHO細胞可見存在較顯著綠色熒光標記，主要分布在胞膜。在正常CHO細胞及轉染空質粒的CHO細胞中未見特異性綠色熒光標記，僅見散在的非特異性綠色熒光雜質。
　　 結論：
　　 1、構建的重組子pJNS4A含有JEV NS4A編碼基因。
　　 2、轉染了重組子pJNS4A的CHO細胞能夠穩(wěn)定表達JEV