NSK三肽對日本腦炎病毒抑制活性的研究.pdf

1、日本腦炎（Janpaneseencephalitis，JE）又稱流行性日本腦炎（簡稱乙腦）是由日本腦炎病毒引起的一種嚴重危害人畜健康的中樞神經系統(tǒng)疾病。日本腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，與西尼羅病毒、登革熱病毒同屬。該病不但影響畜牧業(yè)尤其是養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，而且對人類的健康造成了極大的危害。隨著分子生物學技術的發(fā)展，具有廣譜的抗菌、抗病毒等多種生物活性作用的抗病毒肽逐漸成為開發(fā)這類藥物的極具潛力的藥品之一。
　　病毒在活細胞內的增殖可

2、分為五個環(huán)節(jié)，即吸附、穿入、脫殼、生物合成、成熟組裝與釋放。阻斷病毒感染過程任一環(huán)節(jié)的藥物均可成為抗病毒藥物。E蛋白是乙腦病毒的囊膜蛋白和成熟病毒粒子表面的結構蛋白，可與細胞膜受體相結合從而與細胞膜融合促使病毒進入細胞的主要蛋白，研究表明其與病毒的吸附和入胞有關。抗病毒肽的作用機理一就是與細胞膜表面的一些受體結合從而達到抗病毒的作用。EDⅢloop3抗病毒肽就是通過阻斷病毒體表面位點與細胞表面的受體結合達到抗病毒作用。
　　本研究

3、在EDⅢloop3抗病毒肽基礎上進行篩選得到抗日本腦炎病毒的三肽。研究的主要內容如下:
　　一、實驗室通過對EDⅢloop3抗病毒肽第363-369位氨基酸通過點突變的方法進行改造，測序正確，將質粒轉化Rosetta2大腸桿菌表達蛋白，親合層析和分子篩純化蛋白，通過WesternBlot檢測，結果表明純化得到目的蛋白。
　　二、BHK-21細胞的培養(yǎng)，JEV病毒的擴增，TCID50測定病毒滴度。通過LDH法測定純化的蛋白對于

4、細胞的最大毒性濃度，蝕斑方法檢測突變后EDⅢloop3蛋白對日本腦炎病毒的抑制效果。結果表明N、S、K三個氨基酸在EDⅢ抗日本腦炎病毒中其重要作用。
　　三、利用不同濃度的NSK三肽作用BHK-21細胞后，進行接種日本腦炎病毒，利用蝕斑試驗、實時熒光定量PCR和Westernblot檢測，證明NSK三肽對日本腦炎病毒的抑制效果顯著，實驗表明NSK三肽在濃度為100μM抑制效果極為顯著，并具有劑量依賴性和序列依賴性。
　　四、