CpG ODN誘導(dǎo)大蒲蓮豬和長白豬免疫特點(diǎn)差異及對(duì)PRRSV滅活疫苗免疫力研究.pdf

1、當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)中，疾病特別是傳染性疾病是長期困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要難題。因此，如何擺脫養(yǎng)豬業(yè)對(duì)藥物的過度依賴，提高豬自身的免疫力和抗病力，成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。前期研究發(fā)現(xiàn)我國的地方豬種大蒲蓮豬在抗病性和免疫力方面明顯優(yōu)于國外豬種長白豬。這兩個(gè)豬品種在不同的環(huán)境和選擇壓力下進(jìn)化而來，是尋找抗病和免疫相關(guān)基因的優(yōu)良素材。因此，對(duì)兩豬種免疫應(yīng)答以及免疫相關(guān)差異表達(dá)基因的研究，對(duì)探索豬抗病力差異的遺傳基礎(chǔ)和免疫機(jī)理有深遠(yuǎn)的意義。

2、　　含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的單鏈脫氧寡核苷酸(oligodeo-xynucleotides containing unmethylated CpG motifs,CpG ODN）能夠與TLR9結(jié)合，直接激活機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，進(jìn)而間接激活獲得性免疫系統(tǒng)。因此，CpG ODN被廣泛應(yīng)用于腫瘤、癌癥、病毒感染以及過敏性疾病的治療。此外，CpG ODN在作為疫苗佐劑方面顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。<

3、br>　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染性疾病。該病在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病最主要的防治措施就是接種疫苗。因此，迫

4、切需要有效的疫苗佐劑來增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。
　　1、大蒲蓮豬和長白豬血液生理生化指標(biāo)比較
　　對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞、粒細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明：大蒲蓮豬血液中的紅細(xì)胞（P＜0.01）和淋巴細(xì)胞（P＜0.05）明顯高于長白豬，其他統(tǒng)計(jì)指標(biāo)在兩豬種中并未找到顯著差異（P＞0.05）。對(duì)大蒲蓮豬和長白豬的血液生化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表明：長白豬的堿性磷酸酶（P＜0.05）和白蛋白（P＜0.01）明顯高于大蒲蓮豬，但是大

5、蒲蓮豬的谷草轉(zhuǎn)氨酶（P＜0.05）明顯高于長白豬。
　　2、CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬全血后免疫指標(biāo)比較
　　結(jié)果顯示在大蒲蓮豬中IL1β（P＜0.05）的蛋白表達(dá)水平明顯高于長白豬；而長白豬中IL12（P＜0.05）和C（P＜0.05）反應(yīng)蛋白的蛋白表達(dá)量高于大蒲蓮豬。
　　3、CpG ODN對(duì)大蒲蓮豬和長白豬基因表達(dá)差異研究
　　CpG ODN注射大蒲蓮豬和長白豬后，取全血提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，把

6、結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，在這兩組樣品中共鑒定了500個(gè)差異表達(dá)基因，64.2％（321基因）的差異表達(dá)基因在長白豬中高表達(dá)，35.8%（179基因）在大蒲蓮豬中高表達(dá)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，研究結(jié)果表明免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號(hào)通路。
　　值得注意的是82.8%的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因（24/29）在大蒲蓮豬中高表達(dá)，例如IL1α,IL1β,CXCL8

7、,CXCL10,CCL19,CXCR6（DPL/Landrace倍數(shù)變化分別為3.33,1.74,5.63,2.24,5.55和3.55）。只有17.2%（5/29）的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因在長白豬中高表達(dá)，例如MyD88,CCL23,CCR2和IRF5（Landrace/DPL的倍數(shù)變化分別為6.1845,1.34,1.39和1.20）。COG分析后，發(fā)現(xiàn)500個(gè)差異表達(dá)基因共分成了25個(gè)COG分類，其中 R聚類的差異表達(dá)基因最多，其

8、次為J和T。為了驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果，qRT-PCR用來驗(yàn)證6個(gè)免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，熒光定量結(jié)果與高通量結(jié)果相一致，結(jié)果表明高通量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　挑選了高通量篩選的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了體內(nèi)結(jié)果驗(yàn)證。對(duì)體內(nèi)處理前和處理后的結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示TLR9基因在兩個(gè)豬種處理前和處理后并沒有差異，其中CXCL9和IL1α在兩個(gè)豬種處理前和處理后都沒有差異，但刺激后大蒲蓮豬的倍數(shù)變化高于長白豬。IL8、CXCL1

9、3、CCL3L1和CCL19處理后在大蒲蓮豬中表達(dá)量高于長白豬，IL1β和CXCL2在兩個(gè)豬種中都沒有差異。CXCL10在處理后兩個(gè)豬種中都高表達(dá)，但是大蒲蓮豬仍然高于長白豬。
　　對(duì)SNP和可變剪切事件分析后，發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬平均SNP個(gè)數(shù)為81893，長白豬平均SNP個(gè)數(shù)為32021，大蒲蓮豬的SNP個(gè)數(shù)是長白豬的兩倍還多。Genic SNPs數(shù)目在大蒲蓮豬中高于長白豬，Intergenic SNP在長白豬中高于大蒲蓮豬，而Tra

10、nsition、Transversion、Heterozygosity在兩個(gè)豬種中的個(gè)數(shù)相似。SNP類型中，大蒲蓮豬的堿基替換均高于長白豬。通過對(duì)長白豬和大蒲蓮豬可變剪切進(jìn)行分析和比較，SkippedExon、Alt3splice、IntronRetention和AltFirstExon是兩個(gè)豬種主要的可變剪切。其中，SkippedExon和AltFristExon在大蒲蓮豬中高于長白豬。其他可變剪切在兩個(gè)豬種中的分布相似。
　　

11、體外CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬PBMC后，qRT-PCR研究結(jié)果表明，大蒲蓮豬TLR9基因的表達(dá)量在刺激前和刺激后顯著高于長白豬。同時(shí)對(duì)細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行了熒光定量檢測(cè)，結(jié)果表明細(xì)胞因子（IFNα、IL8、IL12 p40）和趨化因子（CXCL9和CXCL13）在刺激后的基因表達(dá)水平顯著高于長白豬。
　　4、CpG ODN增強(qiáng)PRRSV滅活疫苗免疫力研究
　　體外研究結(jié)果顯示CpG ODN-PRRSV滅活抗原孵育

12、的MoDCs中Th1型細(xì)胞因子的（IFN-γ和IL-12 P40）的mRNA表達(dá)水平顯著增加，Th2型細(xì)胞因子中只有IL4的mRNA表達(dá)水平顯著增加。然而蛋白表達(dá)水平只有 IFN-γ顯著升高。為了進(jìn)一步研究CpG ODN-PRRSV對(duì) MoDCs的作用機(jī)制，研究了CpG ODN與PRRSV孵育組對(duì)TRIF/MyD88-NF-κB信號(hào)通路的影響。對(duì)通路節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)水平分析后，發(fā)現(xiàn)TRIF、MyD88和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平都

13、升高，但是只有MyD88和NF-κB P65的表達(dá)水平達(dá)到顯著差異。檢測(cè)NF-κB P65在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明共同孵育組的蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　綜上所述，大蒲蓮豬和長白豬的血液生理生化指標(biāo)，CpG ODN體外刺激全血后的蛋白表達(dá)水平，CpG ODN體內(nèi)和體外刺激后的基因表達(dá)水平存在差異。此外，TLR9配體CpG ODN可通過TLR/MyD88-NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)MoDCs的抗原遞呈功能。這些結(jié)果為研究中外豬種

14、抗病力差異的遺傳和免疫機(jī)理以及CpG ODN作為疫苗佐劑提供了理論基礎(chǔ)。
　　當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)中，疾病特別是傳染性疾病是長期困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要難題。因此，如何擺脫養(yǎng)豬業(yè)對(duì)藥物的過度依賴，提高豬自身的免疫力和抗病力，成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。前期研究發(fā)現(xiàn)我國的地方豬種大蒲蓮豬在抗病性和免疫力方面明顯優(yōu)于國外豬種長白豬。這兩個(gè)豬品種在不同的環(huán)境和選擇壓力下進(jìn)化而來，是尋找抗病和免疫相關(guān)基因的優(yōu)良素材。因此，對(duì)兩豬種免疫應(yīng)答以及免疫

15、相關(guān)差異表達(dá)基因的研究，對(duì)探索豬抗病力差異的遺傳基礎(chǔ)和免疫機(jī)理有深遠(yuǎn)的意義。
　　含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的單鏈脫氧寡核苷酸(oligodeo-xynucleotides containing unmethylated CpG motifs,CpG ODN）能夠與TLR9結(jié)合，直接激活機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，進(jìn)而間接激活獲得性免疫系統(tǒng)。因此，CpG ODN被廣泛應(yīng)用于腫瘤、癌癥、病毒感染

16、以及過敏性疾病的治療。此外，CpG ODN在作為疫苗佐劑方面顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染性疾病。該病在世界范圍內(nèi)頻繁

17、爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病最主要的防治措施就是接種疫苗。因此，迫切需要有效的疫苗佐劑來增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。
　　1、大蒲蓮豬和長白豬血液生理生化指標(biāo)比較
　　對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞、粒細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明：大蒲蓮豬血液中的紅細(xì)胞（P＜0.01）和淋巴細(xì)胞（P＜0.05）明顯高于長白豬，其他統(tǒng)計(jì)指標(biāo)在兩豬種中并未找到顯著差異（P＞0.05）。對(duì)大蒲蓮豬和長白豬的血液生化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表明

18、：長白豬的堿性磷酸酶（P＜0.05）和白蛋白（P＜0.01）明顯高于大蒲蓮豬，但是大蒲蓮豬的谷草轉(zhuǎn)氨酶（P＜0.05）明顯高于長白豬。
　　2、CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬全血后免疫指標(biāo)比較
　　結(jié)果顯示在大蒲蓮豬中IL1β（P＜0.05）的蛋白表達(dá)水平明顯高于長白豬；而長白豬中IL12（P＜0.05）和C（P＜0.05）反應(yīng)蛋白的蛋白表達(dá)量高于大蒲蓮豬。
　　3、CpG ODN對(duì)大蒲蓮豬和長白豬基因表達(dá)差異研究

19、
　　CpG ODN注射大蒲蓮豬和長白豬后，取全血提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，把結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，在這兩組樣品中共鑒定了500個(gè)差異表達(dá)基因，64.2%（321基因）的差異表達(dá)基因在長白豬中高表達(dá)，35.8%（179基因）在大蒲蓮豬中高表達(dá)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，研究結(jié)果表明免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號(hào)通路。
　　值得注意的是82.8%的免疫相

20、關(guān)的差異表達(dá)基因（24/29）在大蒲蓮豬中高表達(dá)，例如IL1α,IL1β,CXCL8,CXCL10,CCL19,CXCR6（DPL/Landrace倍數(shù)變化分別為3.33,1.74,5.63,2.24,5.55和3.55）。只有17.2%（5/29）的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因在長白豬中高表達(dá)，例如MyD88,CCL23,CCR2和IRF5（Landrace/DPL的倍數(shù)變化分別為6.1845,1.34,1.39和1.20）。COG分析后，

21、發(fā)現(xiàn)500個(gè)差異表達(dá)基因共分成了25個(gè)COG分類，其中 R聚類的差異表達(dá)基因最多，其次為 J和 T。為了驗(yàn)證 RNA-seq結(jié)果，qRT-PCR用來驗(yàn)證6個(gè)免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，熒光定量結(jié)果與高通量結(jié)果相一致，結(jié)果表明高通量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　挑選了高通量篩選的免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了體內(nèi)結(jié)果驗(yàn)證。對(duì)體內(nèi)處理前和處理后的結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示TLR9基因在兩個(gè)豬種處理前和處理后并沒有差異，其中CXCL9和IL1α在

22、兩個(gè)豬種處理前和處理后都沒有差異，但刺激后大蒲蓮豬的倍數(shù)變化高于長白豬。IL8、CXCL13、CCL3L1和CCL19處理后在大蒲蓮豬中表達(dá)量高于長白豬，IL1β和CXCL2在兩個(gè)豬種中都沒有差異。CXCL10在處理后兩個(gè)豬種中都高表達(dá)，但是大蒲蓮豬仍然高于長白豬。
　　對(duì)SNP和可變剪切事件分析后，發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬平均SNP個(gè)數(shù)為81893，長白豬平均SNP個(gè)數(shù)為32021，大蒲蓮豬的SNP個(gè)數(shù)是長白豬的兩倍還多。Genic SNP

23、s數(shù)目在大蒲蓮豬中高于長白豬， Intergenic SNP在長白豬中高于大蒲蓮豬，而 Transition、Transversion、Heterozygosity在兩個(gè)豬種中的個(gè)數(shù)相似。SNP類型中，大蒲蓮豬的堿基替換均高于長白豬。通過對(duì)長白豬和大蒲蓮豬可變剪切進(jìn)行分析和比較，SkippedExon、Alt3splice、IntronRetention和 AltFirstExon是兩個(gè)豬種主要的可變剪切。其中，SkippedExon和

24、 AltFristExon在大蒲蓮豬中高于長白豬。其他可變剪切在兩個(gè)豬種中的分布相似。
　　體外CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬PBMC后，qRT-PCR研究結(jié)果表明，大蒲蓮豬TLR9基因的表達(dá)量在刺激前和刺激后顯著高于長白豬。同時(shí)對(duì)細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行了熒光定量檢測(cè)，結(jié)果表明細(xì)胞因子（IFNα、IL8、IL12 p40）和趨化因子（CXCL9和CXCL13）在刺激后的基因表達(dá)水平顯著高于長白豬。
　　4、CpG ODN

25、增強(qiáng)PRRSV滅活疫苗免疫力研究
　　體外研究結(jié)果顯示CpG ODN-PRRSV滅活抗原孵育的MoDCs中Th1型細(xì)胞因子的（IFN-γ和IL-12 P40）的mRNA表達(dá)水平顯著增加，Th2型細(xì)胞因子中只有IL4的mRNA表達(dá)水平顯著增加。然而蛋白表達(dá)水平只有 IFN-γ顯著升高。為了進(jìn)一步研究 CpG ODN-PRRSV對(duì) MoDCs的作用機(jī)制，研究了 CpG ODN與 PRRSV孵育組對(duì)TRIF/MyD88-NF-κB信號(hào)通

26、路的影響。對(duì)通路節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)水平分析后，發(fā)現(xiàn) TRIF、MyD88和NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平都升高，但是只有MyD88和NF-κB P65的表達(dá)水平達(dá)到顯著差異。檢測(cè)NF-κB P65在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明共同孵育組的蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　綜上所述，大蒲蓮豬和長白豬的血液生理生化指標(biāo)，CpG ODN體外刺激全血后的蛋白表達(dá)水平，CpG ODN體內(nèi)和體外刺激后的基因表達(dá)水平存在差異。此外，TLR9配體Cp