CpG ODN誘導(dǎo)大蒲蓮豬和長白豬免疫特點差異及對PRRSV滅活疫苗免疫力研究.pdf

1、當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)中，疾病特別是傳染性疾病是長期困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要難題。因此，如何擺脫養(yǎng)豬業(yè)對藥物的過度依賴，提高豬自身的免疫力和抗病力，成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。前期研究發(fā)現(xiàn)我國的地方豬種大蒲蓮豬在抗病性和免疫力方面明顯優(yōu)于國外豬種長白豬。這兩個豬品種在不同的環(huán)境和選擇壓力下進化而來，是尋找抗病和免疫相關(guān)基因的優(yōu)良素材。因此，對兩豬種免疫應(yīng)答以及免疫相關(guān)差異表達基因的研究，對探索豬抗病力差異的遺傳基礎(chǔ)和免疫機理有深遠的意義。

2、　　含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的單鏈脫氧寡核苷酸(oligodeo-xynucleotides containing unmethylated CpG motifs,CpG ODN）能夠與TLR9結(jié)合，直接激活機體的先天免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，進而間接激活獲得性免疫系統(tǒng)。因此，CpG ODN被廣泛應(yīng)用于腫瘤、癌癥、病毒感染以及過敏性疾病的治療。此外，CpG ODN在作為疫苗佐劑方面顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。<

3、br>　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染性疾病。該病在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，該病最主要的防治措施就是接種疫苗。因此，迫

4、切需要有效的疫苗佐劑來增強其免疫反應(yīng)。
　　1、大蒲蓮豬和長白豬血液生理生化指標(biāo)比較
　　對紅細胞、白細胞、血小板、淋巴細胞、中間細胞、粒細胞結(jié)果進行了統(tǒng)計，結(jié)果表明：大蒲蓮豬血液中的紅細胞（P＜0.01）和淋巴細胞（P＜0.05）明顯高于長白豬，其他統(tǒng)計指標(biāo)在兩豬種中并未找到顯著差異（P＞0.05）。對大蒲蓮豬和長白豬的血液生化指標(biāo)統(tǒng)計表明：長白豬的堿性磷酸酶（P＜0.05）和白蛋白（P＜0.01）明顯高于大蒲蓮豬，但是大

5、蒲蓮豬的谷草轉(zhuǎn)氨酶（P＜0.05）明顯高于長白豬。
　　2、CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬全血后免疫指標(biāo)比較
　　結(jié)果顯示在大蒲蓮豬中IL1β（P＜0.05）的蛋白表達水平明顯高于長白豬；而長白豬中IL12（P＜0.05）和C（P＜0.05）反應(yīng)蛋白的蛋白表達量高于大蒲蓮豬。
　　3、CpG ODN對大蒲蓮豬和長白豬基因表達差異研究
　　CpG ODN注射大蒲蓮豬和長白豬后，取全血提取RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，把

6、結(jié)果進行生物信息學(xué)分析后，在這兩組樣品中共鑒定了500個差異表達基因，64.2％（321基因）的差異表達基因在長白豬中高表達，35.8%（179基因）在大蒲蓮豬中高表達。對這些差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析，研究結(jié)果表明免疫相關(guān)的差異表達基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號通路。
　　值得注意的是82.8%的免疫相關(guān)的差異表達基因（24/29）在大蒲蓮豬中高表達，例如IL1α,IL1β,CXCL8

7、,CXCL10,CCL19,CXCR6（DPL/Landrace倍數(shù)變化分別為3.33,1.74,5.63,2.24,5.55和3.55）。只有17.2%（5/29）的免疫相關(guān)的差異表達基因在長白豬中高表達，例如MyD88,CCL23,CCR2和IRF5（Landrace/DPL的倍數(shù)變化分別為6.1845,1.34,1.39和1.20）。COG分析后，發(fā)現(xiàn)500個差異表達基因共分成了25個COG分類，其中 R聚類的差異表達基因最多，其

8、次為J和T。為了驗證RNA-seq結(jié)果，qRT-PCR用來驗證6個免疫相關(guān)的差異表達基因，熒光定量結(jié)果與高通量結(jié)果相一致，結(jié)果表明高通量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　挑選了高通量篩選的免疫相關(guān)的差異表達基因進行了體內(nèi)結(jié)果驗證。對體內(nèi)處理前和處理后的結(jié)果進行了分析，結(jié)果顯示TLR9基因在兩個豬種處理前和處理后并沒有差異，其中CXCL9和IL1α在兩個豬種處理前和處理后都沒有差異，但刺激后大蒲蓮豬的倍數(shù)變化高于長白豬。IL8、CXCL1

9、3、CCL3L1和CCL19處理后在大蒲蓮豬中表達量高于長白豬，IL1β和CXCL2在兩個豬種中都沒有差異。CXCL10在處理后兩個豬種中都高表達，但是大蒲蓮豬仍然高于長白豬。
　　對SNP和可變剪切事件分析后，發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬平均SNP個數(shù)為81893，長白豬平均SNP個數(shù)為32021，大蒲蓮豬的SNP個數(shù)是長白豬的兩倍還多。Genic SNPs數(shù)目在大蒲蓮豬中高于長白豬，Intergenic SNP在長白豬中高于大蒲蓮豬，而Tra

10、nsition、Transversion、Heterozygosity在兩個豬種中的個數(shù)相似。SNP類型中，大蒲蓮豬的堿基替換均高于長白豬。通過對長白豬和大蒲蓮豬可變剪切進行分析和比較，SkippedExon、Alt3splice、IntronRetention和AltFirstExon是兩個豬種主要的可變剪切。其中，SkippedExon和AltFristExon在大蒲蓮豬中高于長白豬。其他可變剪切在兩個豬種中的分布相似。
　　

11、體外CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬PBMC后，qRT-PCR研究結(jié)果表明，大蒲蓮豬TLR9基因的表達量在刺激前和刺激后顯著高于長白豬。同時對細胞因子和趨化因子進行了熒光定量檢測，結(jié)果表明細胞因子（IFNα、IL8、IL12 p40）和趨化因子（CXCL9和CXCL13）在刺激后的基因表達水平顯著高于長白豬。
　　4、CpG ODN增強PRRSV滅活疫苗免疫力研究
　　體外研究結(jié)果顯示CpG ODN-PRRSV滅活抗原孵育

12、的MoDCs中Th1型細胞因子的（IFN-γ和IL-12 P40）的mRNA表達水平顯著增加，Th2型細胞因子中只有IL4的mRNA表達水平顯著增加。然而蛋白表達水平只有 IFN-γ顯著升高。為了進一步研究CpG ODN-PRRSV對 MoDCs的作用機制，研究了CpG ODN與PRRSV孵育組對TRIF/MyD88-NF-κB信號通路的影響。對通路節(jié)點基因表達水平分析后，發(fā)現(xiàn)TRIF、MyD88和NF-κB p65 mRNA表達水平都

13、升高，但是只有MyD88和NF-κB P65的表達水平達到顯著差異。檢測NF-κB P65在細胞中的蛋白表達水平，結(jié)果表明共同孵育組的蛋白表達水平顯著升高。
　　綜上所述，大蒲蓮豬和長白豬的血液生理生化指標(biāo)，CpG ODN體外刺激全血后的蛋白表達水平，CpG ODN體內(nèi)和體外刺激后的基因表達水平存在差異。此外，TLR9配體CpG ODN可通過TLR/MyD88-NF-κB信號通路增強MoDCs的抗原遞呈功能。這些結(jié)果為研究中外豬種

14、抗病力差異的遺傳和免疫機理以及CpG ODN作為疫苗佐劑提供了理論基礎(chǔ)。
　　當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)中，疾病特別是傳染性疾病是長期困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要難題。因此，如何擺脫養(yǎng)豬業(yè)對藥物的過度依賴，提高豬自身的免疫力和抗病力，成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。前期研究發(fā)現(xiàn)我國的地方豬種大蒲蓮豬在抗病性和免疫力方面明顯優(yōu)于國外豬種長白豬。這兩個豬品種在不同的環(huán)境和選擇壓力下進化而來，是尋找抗病和免疫相關(guān)基因的優(yōu)良素材。因此，對兩豬種免疫應(yīng)答以及免疫

15、相關(guān)差異表達基因的研究，對探索豬抗病力差異的遺傳基礎(chǔ)和免疫機理有深遠的意義。
　　含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的單鏈脫氧寡核苷酸(oligodeo-xynucleotides containing unmethylated CpG motifs,CpG ODN）能夠與TLR9結(jié)合，直接激活機體的先天免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1型為主的免疫應(yīng)答，進而間接激活獲得性免疫系統(tǒng)。因此，CpG ODN被廣泛應(yīng)用于腫瘤、癌癥、病毒感染

16、以及過敏性疾病的治療。此外，CpG ODN在作為疫苗佐劑方面顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬PRRS病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染性疾病。該病在世界范圍內(nèi)頻繁

17、爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，該病最主要的防治措施就是接種疫苗。因此，迫切需要有效的疫苗佐劑來增強其免疫反應(yīng)。
　　1、大蒲蓮豬和長白豬血液生理生化指標(biāo)比較
　　對紅細胞、白細胞、血小板、淋巴細胞、中間細胞、粒細胞結(jié)果進行了統(tǒng)計，結(jié)果表明：大蒲蓮豬血液中的紅細胞（P＜0.01）和淋巴細胞（P＜0.05）明顯高于長白豬，其他統(tǒng)計指標(biāo)在兩豬種中并未找到顯著差異（P＞0.05）。對大蒲蓮豬和長白豬的血液生化指標(biāo)統(tǒng)計表明

18、：長白豬的堿性磷酸酶（P＜0.05）和白蛋白（P＜0.01）明顯高于大蒲蓮豬，但是大蒲蓮豬的谷草轉(zhuǎn)氨酶（P＜0.05）明顯高于長白豬。
　　2、CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬全血后免疫指標(biāo)比較
　　結(jié)果顯示在大蒲蓮豬中IL1β（P＜0.05）的蛋白表達水平明顯高于長白豬；而長白豬中IL12（P＜0.05）和C（P＜0.05）反應(yīng)蛋白的蛋白表達量高于大蒲蓮豬。
　　3、CpG ODN對大蒲蓮豬和長白豬基因表達差異研究

19、
　　CpG ODN注射大蒲蓮豬和長白豬后，取全血提取RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，把結(jié)果進行生物信息學(xué)分析后，在這兩組樣品中共鑒定了500個差異表達基因，64.2%（321基因）的差異表達基因在長白豬中高表達，35.8%（179基因）在大蒲蓮豬中高表達。對這些差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析，研究結(jié)果表明免疫相關(guān)的差異表達基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號通路。
　　值得注意的是82.8%的免疫相

20、關(guān)的差異表達基因（24/29）在大蒲蓮豬中高表達，例如IL1α,IL1β,CXCL8,CXCL10,CCL19,CXCR6（DPL/Landrace倍數(shù)變化分別為3.33,1.74,5.63,2.24,5.55和3.55）。只有17.2%（5/29）的免疫相關(guān)的差異表達基因在長白豬中高表達，例如MyD88,CCL23,CCR2和IRF5（Landrace/DPL的倍數(shù)變化分別為6.1845,1.34,1.39和1.20）。COG分析后，

21、發(fā)現(xiàn)500個差異表達基因共分成了25個COG分類，其中 R聚類的差異表達基因最多，其次為 J和 T。為了驗證 RNA-seq結(jié)果，qRT-PCR用來驗證6個免疫相關(guān)的差異表達基因，熒光定量結(jié)果與高通量結(jié)果相一致，結(jié)果表明高通量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　挑選了高通量篩選的免疫相關(guān)的差異表達基因進行了體內(nèi)結(jié)果驗證。對體內(nèi)處理前和處理后的結(jié)果進行了分析，結(jié)果顯示TLR9基因在兩個豬種處理前和處理后并沒有差異，其中CXCL9和IL1α在

22、兩個豬種處理前和處理后都沒有差異，但刺激后大蒲蓮豬的倍數(shù)變化高于長白豬。IL8、CXCL13、CCL3L1和CCL19處理后在大蒲蓮豬中表達量高于長白豬，IL1β和CXCL2在兩個豬種中都沒有差異。CXCL10在處理后兩個豬種中都高表達，但是大蒲蓮豬仍然高于長白豬。
　　對SNP和可變剪切事件分析后，發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬平均SNP個數(shù)為81893，長白豬平均SNP個數(shù)為32021，大蒲蓮豬的SNP個數(shù)是長白豬的兩倍還多。Genic SNP

23、s數(shù)目在大蒲蓮豬中高于長白豬， Intergenic SNP在長白豬中高于大蒲蓮豬，而 Transition、Transversion、Heterozygosity在兩個豬種中的個數(shù)相似。SNP類型中，大蒲蓮豬的堿基替換均高于長白豬。通過對長白豬和大蒲蓮豬可變剪切進行分析和比較，SkippedExon、Alt3splice、IntronRetention和 AltFirstExon是兩個豬種主要的可變剪切。其中，SkippedExon和

24、 AltFristExon在大蒲蓮豬中高于長白豬。其他可變剪切在兩個豬種中的分布相似。
　　體外CpG ODN刺激大蒲蓮豬和長白豬PBMC后，qRT-PCR研究結(jié)果表明，大蒲蓮豬TLR9基因的表達量在刺激前和刺激后顯著高于長白豬。同時對細胞因子和趨化因子進行了熒光定量檢測，結(jié)果表明細胞因子（IFNα、IL8、IL12 p40）和趨化因子（CXCL9和CXCL13）在刺激后的基因表達水平顯著高于長白豬。
　　4、CpG ODN

25、增強PRRSV滅活疫苗免疫力研究
　　體外研究結(jié)果顯示CpG ODN-PRRSV滅活抗原孵育的MoDCs中Th1型細胞因子的（IFN-γ和IL-12 P40）的mRNA表達水平顯著增加，Th2型細胞因子中只有IL4的mRNA表達水平顯著增加。然而蛋白表達水平只有 IFN-γ顯著升高。為了進一步研究 CpG ODN-PRRSV對 MoDCs的作用機制，研究了 CpG ODN與 PRRSV孵育組對TRIF/MyD88-NF-κB信號通

26、路的影響。對通路節(jié)點基因表達水平分析后，發(fā)現(xiàn) TRIF、MyD88和NF-κB p65 mRNA表達水平都升高，但是只有MyD88和NF-κB P65的表達水平達到顯著差異。檢測NF-κB P65在細胞中的蛋白表達水平，結(jié)果表明共同孵育組的蛋白表達水平顯著升高。
　　綜上所述，大蒲蓮豬和長白豬的血液生理生化指標(biāo)，CpG ODN體外刺激全血后的蛋白表達水平，CpG ODN體內(nèi)和體外刺激后的基因表達水平存在差異。此外，TLR9配體Cp