豬偽狂犬病滅活疫苗(JS-2012-△gI-gE株)免疫效力的研究.pdf

1、根據(jù)偽狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）gB基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一套特異引物和TaqMan探針，建立了一種快速、敏感和特異的檢測偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法靈敏度高，可檢測到相當(dāng)于10拷貝/μL的病毒DNA，比常規(guī)PCR檢測方法高約100倍。該方法特異性強(qiáng)，與豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）均無交叉反應(yīng)。該方法變異系數(shù)小于1％，具有良好的重復(fù)性

2、。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可用于偽狂犬病毒經(jīng)典株和變異株的檢測和定量。
　　為了研究豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）的免疫原性，確定其對(duì)豬的最小免疫劑量，進(jìn)行了仔豬免疫攻毒試驗(yàn)。25頭2周齡PRV抗原和抗體陰性的健康仔豬，隨機(jī)分為5組，每組5頭。第1—4組分別頸部肌肉注射豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）0.5 mL、1 mL、2 mL和3 mL，28天后每組用同等劑量疫苗加強(qiáng)免疫一

3、次，第5組為對(duì)照組。各組豬在免疫后，每周采集血清檢測PRV gE和gB抗體水平。第二次免疫后第28天，所有豬用105.0 TCID50的豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒（JS-2012株）滴鼻接種。攻毒后，每天測量體溫并記錄臨床癥狀，14天后剖解，觀察病理變化。結(jié)果顯示，第一次免疫后14天，第2—4組豬 PRV gB抗體全部轉(zhuǎn)為陽性，而第1組豬在第一次免疫后21天全部轉(zhuǎn)陽。豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）1 mL、2 mL和3 mL

4、免疫都能為仔豬提供良好的保護(hù)，免疫豬在攻毒后除了表現(xiàn)為一過性的發(fā)熱外，沒有明顯的臨床癥狀和病理變化。而0.5 mL免疫組有1頭豬表現(xiàn)為精神沉郁、厭食和輕微的神經(jīng)癥狀，其余4頭只有一過性的發(fā)熱。對(duì)照組豬在攻毒后表現(xiàn)為高熱（41℃以上）、精神沉郁、厭食和嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，腦和肺部表現(xiàn)為出血等明顯的病理變化，有2頭死亡?；谝陨辖Y(jié)果，確定豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）的最小免疫劑量為1 mL。
　　為滿足動(dòng)物福利要求

5、，在成品疫苗免疫效力評(píng)價(jià)中減少本體動(dòng)物的使用，本研究嘗試使用小鼠評(píng)價(jià)了豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）免疫效力，共進(jìn)行了兩次小鼠免疫攻毒試驗(yàn)。45只6周齡昆明小鼠，隨機(jī)分為5組。第1—4組每組10只，每組分別皮下注射豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL，28天后每組用同等劑量疫苗加強(qiáng)免疫一次。第二次免疫后第21天，連同第5組5只對(duì)照小鼠，皮下注射

6、豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒（JS-2012株）的病毒培養(yǎng)液0.1 mL（含50 LD50）。攻毒后，每天記錄小鼠的發(fā)病、死亡情況。結(jié)果顯示，攻毒后，0.05 mL和0.1 mL免疫組分別有3只和2只小鼠死亡，0.2 mL和0.3 mL免疫組小鼠全部存活，對(duì)照組小鼠全部死亡。為了驗(yàn)證用小鼠評(píng)價(jià)豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）的可靠性，本研究重復(fù)了一次小鼠免疫攻毒試驗(yàn)，并且在攻毒后第10天每組隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行剖解，觀察病理變化

7、，并提取臟器組織DNA，用前面建立的熒光定量PCR方法檢測病毒核酸。結(jié)果顯示，對(duì)照組病毒核酸含量最高，小鼠全部死亡，而其它免疫組小鼠只檢測到少量或沒有檢測到病毒核酸，所有免疫組小鼠全部存活。兩次小鼠試驗(yàn)存活率存在一些差別，這可能與免疫和攻毒操作的精準(zhǔn)度相關(guān)。但總的來說，隨著免疫劑量的提高，小鼠的發(fā)病率和死亡率隨之降低，這與豬的試驗(yàn)結(jié)果是一致的。因此，用小鼠替代仔豬對(duì)豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-ΔgI/gE株）進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)是可