基于CpG基序的生長(zhǎng)抑素基因新疫苗的構(gòu)建與鑒定及免疫效果與作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文應(yīng)用基因克隆、免疫中和、酶免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定等技術(shù)，構(gòu)建含CpG基序的生長(zhǎng)抑素表達(dá)質(zhì)粒pES／2SS-CpG，并以pES／2SS、pES／2SS-CpG、pES／2SS+pE-CpG免疫小鼠，分析CpG序列協(xié)同生長(zhǎng)抑素基因免疫對(duì)免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)激素水平的影響，旨在研究如何利用CpG來(lái)作為有效的生長(zhǎng)抑素基因疫苗分子佐劑。主要內(nèi)容如下： 1．含CpG的生長(zhǎng)抑素基因新疫苗pES／2SS-CpG的構(gòu)建與鑒定

2、設(shè)計(jì)并化學(xué)合成兩條含有8個(gè)CpG基序的CpG-ODN，95℃退火成雙鏈，插入到質(zhì)粒pES／2SS中，酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建了生長(zhǎng)抑素基因疫苗pES／2SS-CpG，為利用分子佐劑提高生長(zhǎng)抑素基因免疫效果奠定基礎(chǔ)。 2．含CpG生長(zhǎng)抑素基因疫苗免疫小鼠引起的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答 40只小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)。采用小鼠股四頭肌三點(diǎn)注射法，每次免疫前24小時(shí)注射0.5％鹽酸普魯卡因20μl預(yù)處理。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(T1～

3、T3)：真核表達(dá)質(zhì)粒pES／SS(T1)、pES／2SS-CpG(T2)、pES／2SS+pE-CpG(T3)按劑量20μg／20μl于預(yù)處理相同部位注射；1個(gè)對(duì)照組：生理鹽水組(C)注射生理鹽水20μl，注射方法同試驗(yàn)組。血漿稀釋50倍后ELISA法測(cè)定P／N值，以P／N值>2.0判為陽(yáng)性。RIA法測(cè)定血漿中GH、IGF-I濃度。 周ELISA檢測(cè)抗體水平和抗體類(lèi)型，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示：三個(gè)實(shí)驗(yàn)組抗體陽(yáng)性率

4、在30.0％～40.0％，均極顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)，P／N值最高為3.76，含有CpG的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組效果較好，抗體陽(yáng)性率均為40.0％，但與pES／2SS免疫組30.0％比較差異不顯著；三個(gè)疫苗組的淋巴細(xì)胞增殖能力極顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)，含有CpG的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組SI值雖高于pES／SS組，但差異不顯著。這些結(jié)果表明，應(yīng)用CpG DNA序列可以增強(qiáng)生長(zhǎng)抑素基因疫苗的免疫效果。 3．含CpG生長(zhǎng)抑素基

5、因免疫對(duì)小鼠生長(zhǎng)及生長(zhǎng)相關(guān)激素的影響 免疫后2、4周，含有cpG序列的T3組雌性小鼠增重速度最快，顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)，但與T1、T2組差異不顯著(P>0.05)；T1、T2組增重速度雖高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；雄性小鼠免疫后各個(gè)時(shí)期，疫苗組與對(duì)照組平均增重相比，均差異不顯著。含有CpG的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的GH水平雖然高于pES／2SS組，但整體差異不顯著，只有pES／2SS+pE-CpG組在免疫后第