ZAC基因在生長(zhǎng)抑素抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)通路的作用.pdf

1、胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在消化道惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率居首位。外科手術(shù)是治療胃癌的主要手段，但5年存活率很低。化療和放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷正常組織的細(xì)胞，且患者有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，尋找更多基因治療的靶點(diǎn)對(duì)提高胃癌的治療水平及患者的生存率成為臨床研究的熱點(diǎn)。
　　調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的鋅指蛋白(zinc finger protein which regulatesapoptosis and cell cycl

2、e arrest，ZAC)為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。前期的研究表明胃癌組織ZAC基因及生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)表達(dá)均下調(diào)，且二者呈明顯正相關(guān)，參與胃癌的發(fā)生。為觀察SST是否可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ZAC基因的表達(dá)，本研究觀察了SST類似物奧曲肽(octreotide，OCT)對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表達(dá)的效應(yīng);為評(píng)定ZA

3、C基因在SST抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)通路的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立了ZAC基因敲低(knock-down)胃癌細(xì)胞系(ZAC-KD)，觀察ZAC基因沉默后OCT孵育對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及細(xì)胞凋亡的作用。
　　方法：
　　1.MTT法篩選OCT作用的最佳條件用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L的OCT孵育胃癌細(xì)胞系BGC823及SGC7901，分別于12h、24h和48h后，應(yīng)用

4、MTT技術(shù)檢測(cè)生長(zhǎng)抑素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖效應(yīng)，篩選OCT抑制胃癌細(xì)胞增殖最佳作用濃度和作用時(shí)間。
　　2.OCT對(duì)胃癌細(xì)胞ZAC基因的效應(yīng)以最佳濃度和時(shí)間OCT孵育胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901，應(yīng)用Western blot檢測(cè)OCT對(duì)胃癌細(xì)胞ZAC基因表達(dá)的效應(yīng)。
　　3.構(gòu)建ZAC-shRNA表達(dá)載體根據(jù)ZAC基因在GenBank中所查到的mRNA序列，通過在線設(shè)計(jì)和同源性比較確定3條靶向ZAC基因的siRNA序列，

5、交由生物公司合成互補(bǔ)性發(fā)卡樣寡核苷酸。退火形成雙鏈后，插入pSUPER-EGFP-I質(zhì)粒中，構(gòu)建3個(gè)ZAC-shRNA表達(dá)載體:pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3。HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切及序列分析鑒定。
　　4.建立ZAC-KD胃癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901的培養(yǎng)體系采用無(wú)抗生素培養(yǎng)基。各質(zhì)粒提取均采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。分實(shí)驗(yàn)組(分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

6、pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSUPER-EGFP-I)和對(duì)照組（無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，G418選擇性篩選近3周。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ZAC mRNA水平，建立ZAC基因敲低的BGC823細(xì)胞系和SGC7901細(xì)胞系，分別命名為ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901。
　　5.OC

7、T孵育對(duì)ZAC-KD胃癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)以最佳濃度和時(shí)間OCT孵育胃癌細(xì)胞系BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901，應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)觀察OCT對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)， P＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果
　　1.OCT作用最佳條件MTT結(jié)

8、果顯示，OCT對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)具有濃度和時(shí)間依賴性;10nmol/L，作用24h，OCT對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901的增殖抑制效應(yīng)最佳。
　　2.OCT對(duì)胃癌細(xì)胞ZAC基因的效應(yīng)1nmol/L～1000 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，OCT以濃度依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901ZAC基因的表達(dá);12h～48h范圍內(nèi)，10nmol/L OCT以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901

9、ZAC基因的表達(dá)。
　　3.ZAC-shRN表達(dá)載體構(gòu)建酶切及測(cè)序鑒定，插入片段正確，3個(gè)shRNA表達(dá)載體，pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3構(gòu)建成功。
　　4.建立ZAC-KD胃癌細(xì)胞系ZAC和β-actin擴(kuò)增的片段分別為428 bp和250bp。BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER- EGFP-Z3、pSUP

10、ER-EGFP-I和對(duì)照組的ZAC/β-actin灰度比值的均值分別為0.982±0.017、0.463±0.051、0.935±0.026、1.135±0.055和1.233±0.050; SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER-EGFP-Z3、pSUPER-EGFP-I和對(duì)照組的ZAC/β-actin灰度比值的均值分別為0.956±0.047、0.527±0.010、0.966

11、±0.014、1.107±0.003和1.156±0.007。轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z2的BGC823和SGC7901細(xì)胞ZAC mRNA水平均均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z2的胃癌細(xì)胞系為ZAC-KD胃癌細(xì)胞系。
　　5.OCT孵育對(duì)ZAC-KD胃癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)MTT結(jié)果顯示，BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901細(xì)胞增

12、殖率分別為0.383±0.014、0.469±0.012、0.368±0.016和0.434±0.012; OCT孵育后，細(xì)胞增殖率分別為0.306±0.006、0.450±0.011、0.274±0.013和0.415±0.007。ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901細(xì)胞增殖率均明顯增高(P＜0.05)。OCT孵育后，胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901細(xì)胞增殖率均明顯下降(P＜0.05);而ZAC-KD/BGC

13、823和ZAC-KD/SGC7901細(xì)胞增殖率無(wú)明顯改變(P＞0.05)。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，OCT孵育后，ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901細(xì)胞凋亡率（7.29％和7.19％）均低于其相應(yīng)的胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901(26.72％和28.21％)。
　　結(jié)論
　　1.OCT以濃度和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表達(dá)。
　　2.ZAC基因在SST抑制