ZAC基因在生長抑素抑制胃癌細胞生長通路的作用.pdf

1、胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在消化道惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率居首位。外科手術(shù)是治療胃癌的主要手段，但5年存活率很低?；熀头暖熢跉⑺腊┘毎耐瑫r也會損傷正常組織的細胞，且患者有嚴重的不良反應(yīng)。因此，尋找更多基因治療的靶點對提高胃癌的治療水平及患者的生存率成為臨床研究的熱點。
　　調(diào)控細胞周期阻滯和細胞凋亡的鋅指蛋白(zinc finger protein which regulatesapoptosis and cell cycl

2、e arrest，ZAC)為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄活化活性和DNA結(jié)合功能，可誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞G1期阻滯，從而抑制腫瘤細胞生長。前期的研究表明胃癌組織ZAC基因及生長抑素(somatostatin，SST)表達均下調(diào)，且二者呈明顯正相關(guān)，參與胃癌的發(fā)生。為觀察SST是否可誘導(dǎo)胃癌細胞ZAC基因的表達，本研究觀察了SST類似物奧曲肽(octreotide，OCT)對胃癌細胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表達的效應(yīng);為評定ZA

3、C基因在SST抑制胃癌細胞生長通路的作用，本實驗應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立了ZAC基因敲低(knock-down)胃癌細胞系(ZAC-KD)，觀察ZAC基因沉默后OCT孵育對胃癌細胞的生長抑制作用及細胞凋亡的作用。
　　方法：
　　1.MTT法篩選OCT作用的最佳條件用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L的OCT孵育胃癌細胞系BGC823及SGC7901，分別于12h、24h和48h后，應(yīng)用

4、MTT技術(shù)檢測生長抑素對胃癌細胞增殖效應(yīng)，篩選OCT抑制胃癌細胞增殖最佳作用濃度和作用時間。
　　2.OCT對胃癌細胞ZAC基因的效應(yīng)以最佳濃度和時間OCT孵育胃癌細胞系BGC823和SGC7901，應(yīng)用Western blot檢測OCT對胃癌細胞ZAC基因表達的效應(yīng)。
　　3.構(gòu)建ZAC-shRNA表達載體根據(jù)ZAC基因在GenBank中所查到的mRNA序列，通過在線設(shè)計和同源性比較確定3條靶向ZAC基因的siRNA序列，

5、交由生物公司合成互補性發(fā)卡樣寡核苷酸。退火形成雙鏈后，插入pSUPER-EGFP-I質(zhì)粒中，構(gòu)建3個ZAC-shRNA表達載體:pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3。HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切及序列分析鑒定。
　　4.建立ZAC-KD胃癌細胞系轉(zhuǎn)染前胃癌細胞系BGC823和SGC7901的培養(yǎng)體系采用無抗生素培養(yǎng)基。各質(zhì)粒提取均采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。分實驗組(分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

6、pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3)、實驗對照組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSUPER-EGFP-I)和對照組（無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，G418選擇性篩選近3周。RT-PCR技術(shù)檢測ZAC mRNA水平，建立ZAC基因敲低的BGC823細胞系和SGC7901細胞系，分別命名為ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901。
　　5.OC

7、T孵育對ZAC-KD胃癌細胞系細胞增殖及細胞凋亡的效應(yīng)以最佳濃度和時間OCT孵育胃癌細胞系BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901，應(yīng)用MTT法和流式細胞技術(shù)觀察OCT對胃癌細胞增殖和細胞凋亡的效應(yīng)。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)， P＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果
　　1.OCT作用最佳條件MTT結(jié)

8、果顯示，OCT對胃癌細胞的增殖抑制效應(yīng)具有濃度和時間依賴性;10nmol/L，作用24h，OCT對胃癌細胞系BGC823和SGC7901的增殖抑制效應(yīng)最佳。
　　2.OCT對胃癌細胞ZAC基因的效應(yīng)1nmol/L～1000 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，OCT以濃度依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細胞BGC823和SGC7901ZAC基因的表達;12h～48h范圍內(nèi)，10nmol/L OCT以時間依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細胞BGC823和SGC7901

9、ZAC基因的表達。
　　3.ZAC-shRN表達載體構(gòu)建酶切及測序鑒定，插入片段正確，3個shRNA表達載體，pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3構(gòu)建成功。
　　4.建立ZAC-KD胃癌細胞系ZAC和β-actin擴增的片段分別為428 bp和250bp。BGC823細胞轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER- EGFP-Z3、pSUP

10、ER-EGFP-I和對照組的ZAC/β-actin灰度比值的均值分別為0.982±0.017、0.463±0.051、0.935±0.026、1.135±0.055和1.233±0.050; SGC7901細胞轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER-EGFP-Z3、pSUPER-EGFP-I和對照組的ZAC/β-actin灰度比值的均值分別為0.956±0.047、0.527±0.010、0.966

11、±0.014、1.107±0.003和1.156±0.007。轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z2的BGC823和SGC7901細胞ZAC mRNA水平均均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-Z2的胃癌細胞系為ZAC-KD胃癌細胞系。
　　5.OCT孵育對ZAC-KD胃癌細胞系細胞增殖及細胞凋亡的效應(yīng)MTT結(jié)果顯示，BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901細胞增

12、殖率分別為0.383±0.014、0.469±0.012、0.368±0.016和0.434±0.012; OCT孵育后，細胞增殖率分別為0.306±0.006、0.450±0.011、0.274±0.013和0.415±0.007。ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901細胞增殖率均明顯增高(P＜0.05)。OCT孵育后，胃癌細胞系BGC823和SGC7901細胞增殖率均明顯下降(P＜0.05);而ZAC-KD/BGC

13、823和ZAC-KD/SGC7901細胞增殖率無明顯改變(P＞0.05)。流式細胞結(jié)果顯示，OCT孵育后，ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901細胞凋亡率（7.29％和7.19％）均低于其相應(yīng)的胃癌細胞系BGC823和SGC7901(26.72％和28.21％)。
　　結(jié)論
　　1.OCT以濃度和時間依賴的方式誘導(dǎo)胃癌細胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表達。
　　2.ZAC基因在SST抑制