褪黑激素對(duì)水牛顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)抑素基因疫苗免疫程序及安全性研究.pdf

1、奶水牛和生豬是國(guó)家鼓勵(lì)和優(yōu)先發(fā)展的兩大產(chǎn)業(yè)。開(kāi)發(fā)提高水牛繁殖力和豬生長(zhǎng)速度的新技術(shù)，是促進(jìn)上述兩大產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要舉措。為了:①探討水牛卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)水牛繁殖新技術(shù)的發(fā)展;②優(yōu)化生長(zhǎng)抑素基因免疫程度，分析該疫苗的生物安全性，促進(jìn)該疫苗的推廣應(yīng)用本研究利用。因此本研究從褪黑激素對(duì)水牛卵泡顆粒細(xì)胞體外調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)抑素基因免疫程序優(yōu)化與安全性評(píng)定等角度開(kāi)展研究，主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.褪黑激素對(duì)水牛顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制

2、研究
　　褪黑激素(MLT)受光信號(hào)控制，對(duì)生殖系統(tǒng)、特別是卵巢功能具有調(diào)節(jié)作用。MLT對(duì)水牛卵泡發(fā)育是否有調(diào)節(jié)作用，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從顆粒細(xì)胞的褪黑激素受體表達(dá)、調(diào)節(jié)及外源MLT對(duì)水牛顆粒細(xì)胞凋亡、增殖與激素分泌等方面進(jìn)行了研究，主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)提取水牛顆粒細(xì)胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得細(xì)胞cNDA，并成功擴(kuò)增出MT1受體特異性條帶，表明水牛顆粒細(xì)胞表達(dá)褪黑激素受體。
　　(2)將水牛顆粒細(xì)胞用含低（0.1

3、nM）、中（1nM）、高（100nM）劑量MLT的培養(yǎng)液處理24小時(shí)，在mRNA水平檢測(cè)MT1及相關(guān)受體的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT1受體表達(dá)在各濃度MLT作用下明顯上調(diào)，F(xiàn)SH和GnRH受體表達(dá)顯著下降，LH受體表達(dá)在高劑量組顯著上調(diào)，中、低劑量組無(wú)顯著變化。
　　(3)用MLT處理水牛顆粒細(xì)胞24h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及增殖情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，高劑量組的細(xì)胞凋亡顯著減少，中、低劑量組組無(wú)明顯差異;另外，中、高劑量組細(xì)

4、胞增殖明顯高于對(duì)照組，低劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。用WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)中、高劑量組中bcl2表達(dá)顯著上調(diào)，高劑量組中caspase3、p21和p27表達(dá)明顯下降，這與流式檢測(cè)結(jié)果一致。測(cè)定培養(yǎng)液中雌激素和孕激素濃度，發(fā)現(xiàn)高劑量組的孕激素分泌明顯減少，而各組的雌激素分泌量變化不明顯。
　　2.生長(zhǎng)抑素基因疫苗免疫程序及安全性研究
　　本研究選擇45日齡杜長(zhǎng)大三元雜交豬25頭，分成5組，從免疫原(P

5、cs/2SS)劑量（0.5mg，1.0mg，2.0mg）和免疫方式（電轉(zhuǎn)化和肌肉注射）以及安全性評(píng)價(jià)等方面著手，比較了各種劑量、兩種給藥方式的免疫和促生長(zhǎng)效果，分析了目的基因整合情況，結(jié)果如下:
　　(1)免疫質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)組豬均有抗體產(chǎn)生，表明疫苗引發(fā)了機(jī)體的免疫應(yīng)答。在初次免疫和加強(qiáng)免疫第2周，抗體陽(yáng)性豬比例最高，加強(qiáng)免疫后體內(nèi)抗體水平的維持時(shí)間與初次免疫相比明顯增長(zhǎng)。同時(shí)，在加強(qiáng)免疫后的第2周生長(zhǎng)速度也達(dá)到高峰，但各組動(dòng)物激素